التصوير تلألؤ بيولوجي لنموذج مناعيا الحيوان ورم أرومي دبقي
Summary
GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.
Abstract
In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and histopathologic features of the human disease. When GL261 cells are implanted intracranially in syngeneic C57BL/6 mice, the model has the added advantage of maintaining an intact immune microenvironment. Stable expression of luciferase in GL261 cells allows non-invasive cost effective bioluminescence monitoring of intracranial tumor growth. We have recently demonstrated that luciferase expression in GL261 cells does not affect the tumor growth properties, tumor cell immunomodulatory cytokine expression, infiltration of immune cells into the tumor, or overall survival of animals bearing the intracranial tumor. Therefore, it appears that the GL261 luciferase glioma model can be useful in the study of novel chemotherapeutic and immunotherapeutic modalities. Here we report the technique for generating stable luciferase expression in GL261 cells and how to study the in vitro and in vivo growth of the tumor cells by bioluminescence imaging.
Introduction
Malignant glioma is the most common and most lethal human brain tumor. Even when treated with maximal surgical resection, radiotherapy, and chemotherapy, median survival remains 15-20 months at major brain tumor referral centers1, 2, 3. The most aggressive form of malignant glioma, glioblastoma, is characterized by mitotic figures, neovascularization, invasion into adjacent brain, and pseudopalisading necrosis. Orthotopic brain tumor xenografts using human brain tumor cells have served an essential function in neuro-oncology research and facilitated pre-clinical translation for testing of new agents, prior to entry into human clinical trials. Whereas most of human xenograft models recapitulate many features of the human disease, a fundamental limitation with all human-based xenograft model systems is the use of immunodeficient animals4.
The absence of an intact host response clearly modifies tumor growth both in terms of tumor morphology, and efficiency of engraftment. While certain assumptions are acceptable in the interpretation of results from xenografted models, achieving relevant conclusions in the area of therapeutic assessment is a challenge. Certain fundamental biologic features are likely to be similar in immunodeficient and immunocompetent animals, but others such as tumor associated inflammation, tissue invasion, response to injury are probably very different. In contrast, GL261 is a chemically induced murine glioma cell line that accurately recapitulates glioma when implanted into the brains of immunocompetent syngeneic C57BL/6 mice5. Similar to the human disease, intracranial tumor growth rapidly and reproducibly leads to neurologic symptoms and animal demise6-10.
Subcutaneous tumor growth can be directly measured. Intracranial tumor growth can only be measured with animal sacrifice or with costly imaging studies. Stable expression of the enzyme luciferase allows non-invasive and cost-effective intracranial bioluminescence imaging11. Bioluminescence of luciferase transfected GL261 cells correlates well with intracranial tumor growth. We have recently directly compared GL261 to luciferase modified GL261 cells and demonstrated no difference in in vitro growth and invasion, immunologic cytokine profile, in vivo survival of intracranial tumor bearing C57BL/6 mice, or immune cell infiltrate. This technique is applicable to glioblastoma preclinical studies which involve non-invasive monitoring of tumor growth.
Protocol
Representative Results
Discussion
GL261 خلايا الورم الفئران، عندما زرعت intracranially إلى مناعيا مسانج C57BL / 6 الفئران، وتقديم العديد من المزايا مقارنة مع الورم طعم أجنبي نماذج حيوانية الإنسان. تنمو العديد من الأورام xenografted كما الآفات مغلفة التي لا ألخص بدقة الأمراض التي تصيب البشر الغازية. في المقابل، GL261 الورم يوضح ليس فقط الغزو في الدماغ المجاورة، ولكن أيضا اتساع الأوعية الدموية، والشخصيات الإنقسامية، ونخر عميق 7. الأهم من ذلك عند دراسة علم المناعة الورم أو استراتيجيات immunotherapeutic 15، 16، يحتفظ الماوس C57BL / 6 الجهاز المناعي سليمة 8. وقد أظهرت دراسات سابقة التعبير القوي للمناعة خلوى TGF-β والأورام داخل الجمجمة تحتوي على خلايا T التنظيمية المثبطة للمناعة مشابهة لورم أرومي البشري 9، 10.
تقنية بسيطة وصفها هنا يسمح للتعبير مستقر من luciferase المراسل من قبل خلايا GL261. لقد ذكرت مؤخرا سيميلار في التجارب المختبرية ونمو الجسم الحي من خلايا GL261.luc بالمقارنة مع خلايا GL261، بالإضافة إلى خصائص الورم نسيجية مماثلة، والخلايا المناعية تسلل 17. خلايا GL261.luc التعبير عن ثابت luciferase المراسل الذي يحفز أكسدة الركيزة luciferin تحويل الطاقة الكيميائية إلى فوتونات الضوء وبالتالي يمكن كشفها. وسيفيرين يمكن أن تدار بشكل آمن للحيوانات ويعبر حاجز الدم في الدماغ بعد الحقن داخل الصفاق أو عن طريق الوريد. في حيوانات التجارب الصغيرة مثل الفئران، ويمكن أن يتم الكشف عن تلألؤ بيولوجي في الخارج بطريقة غير الغازية 11. ولذلك، نمو الورم يمكن تقييمها بشكل متسلسل دون الحاجة إلى التضحية الحيوانية أو مكلفا MRI أو التصوير CT.
الخطوات الحاسمة في البروتوكول تشمل، ليس فقط تنبيغ lentiviral، ولكن أيضا التحقق من التعبير مستقر من luciferase المراسل في المختبر قبل البدء في أي التجارب في الجسم الحي. فقدان تنبيغ قد REQUIإعادة عدوى الفيروسة البطيئة تكرار. ويمكن أيضا إدخال الجينات المقاومة للمضادات الحيوية في ناقلات التعبير أن تستخدم لتحديد للتعبير عن luciferase المراسل. مطلوب تقنية دقيقة لزرع داخل الجمجمة لوضع بتكاثر عدد ثابت من الخلايا في الموقع التشريحي الدقيق للسماح للمقارنة بين مجموعات العلاج المختلفة. وهناك فرق كبير بين الدراسة الحالية والدراسات السابقة من luciferase المراسل معربا عن الخلايا GL261 هو استخدام تقنية الحرية لزرع خلايا مقارنة مع استخدام إطار المجسم 18. لقد أثبتنا سابقا نتائج زرع متسقة مع اليد تقنية حرة (19). الاستفادة من تقنية الحرية هي القدرة على إجراء تحليلات إنتاجية عالية وكلاء معاملة مختلفة. في أيدينا، ونحن يمكن زرع حوالي 60 حيوانا في 1 ساعة.
بعد إتقان هذه التقنية، والتطبيقات المستقبلية للتقنية لا حدود لهما. كما GL261 demonstrآتش مرتفعة mitoses ونمو الأورام السريع مشابه لورم أرومي البشري، يمكن تقييم العلاجات المضادة للالتكاثري. وبالمثل، العلاجات المضادة للالغازية والمعادية للعائية ويمكن استخدام الأورام GL261 هي الغازية وعائية. ينبغي توخي الحذر عند تقييم تأثير العلاج الكيميائي وكلاء تستهدف أهدافا الإنسان. مقارنة مع الدراسات السابقة باستخدام xenografts ورم أرومي الإنسان معربا عن luciferase المراسل 20، وهذا من شأنه أن يعتبر الحد من نموذجنا. أيضا، وأثر استراتيجيات immunotherapeutic من نمو الورم يمكن دراستها في نموذج xenografted GL261.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Rajwant Kaur for technical assistance. We would like to thank Maxwell Tom for assistance with lentivirus preparation. This work was supported by the Reza and Georgianna Khatib Endowed Chair in Skull Base Tumor Surgery at UCSF, and the Michael J. Marchese Professor and Chair at Northwestern University.
Materials
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechonology | LUCK-100 | Store away from light |
| Living Image Software | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
| Xenogen Lumina | Caliper Life Sciences | Contact for Quote | none |
| 24-well; Standard tissue culture; flat-bottom | Falcon | 353047 | |
| CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | none |
| Synergy 2 Multi-Mode Reader | BioTek | Contact for Quote | none |
| 96 well Assay Plate, Black Plate, Clear bottom with Lid, Tissue culture Tretaed | Coster | 3603 | none |
| Ketaset | Pfizer | NDC 0856-2013-01 | Control substance |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | 23076-35-9 | none |
| 28G Needle (with syringe) | Fisher | 22-004-270 | AKA Insulin Syringe |
| 2% Chlorhexidine | Fisher | NC9756995 | AKA “Nolvasan” |
| 3% Hydrogen Peroxide | Fisher | H312P-4 | Store away from light |
| Ophthalmic Ointment | Cardinal Health | 1272830 | AKA “Akwa Tears” |
| 25G 1 1/2 needle | BD Becton Dickinson | 305127 | none |
| Disposable Scalpels | Feather | 2975 | No. 21 |
| Gauze | Fisher | 22028563 | Autoclave before use |
| Heating Pad | Dunlap | HP950 | none |
| Skin Stapler, Staples, Remover | Stoelting | 59020 | none |
| PDI Alchol Prep Pads | Fisher | 23-501-711 | none |
| Reflex 7mm Wound Clips 100 pack | Brain Tree Scientific, INC | 203 1000 | Autoclave before use |
| Reflex 7mm Wound Clip Applier | Brain Tree Scientific, INC | 204 1000 | Autoclave before use |
| Reflex 7mm Wound Clip Remover | Brain Tree Scientific, INC | 205 1000 | none |
| Single Ended Round Tip Swab with Wood handle | Qosmedix | 10107 | Autoclave before use |
| Hanks' Balanced Salt Solution without Ca2+ and Mg2+ (HBSS) | Gibco | 14170-112 | none |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 80300 | none |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2961 | none |
| Bone Wax | Harvard Apparatus | 599864 | none |
References
- Clark, A. J., et al. Neurosurgical management and prognosis of patients with glioblastoma that progresses during bevacizumab treatment. Neurosurgery. 70 (2), 361-370 (2012).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
- Grossman, S. A., et al. Survival of patients with newly diagnosed glioblastoma treated with radiation and temozolomide in research studies in the United States. Clin Cancer Res. 16 (8), 2443-2449 (2010).
- Sughrue, M. E., et al. Immunological considerations of modern animal models of malignant primary brain tumors. J Transl Med. 7 (84), (2009).
- Ausman, J. I., Shapiro, W. R., Rall, D. P. Studies on the chemotherapy of experimental brain tumors: development of an experimental model. Cancer Res. 30 (9), 2394-2400 (1970).
- Zagzag, D., Zhong, H., Scalzitti, J. M., Laughner, E., Simons, J. W., Semenza, G. L. Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha in brain tumors: association with angiogenesis, invasion, and progression. Cancer. 88 (11), 2606-2618 (2000).
- Cha, S., et al. Dynamic, contrast-enhanced perfusion MRI in mouse gliomas: correlation with histopathology. Magn Reson Med. 49 (5), 848-855 (2003).
- Ksendzovsky, A., et al. Investigation of immunosuppressive mechanisms in a mouse glioma model. J Neurooncol. 93 (1), 107-114 (2009).
- Biollaz, G., et al. Site-specific anti-tumor immunity: differences in DC function, TGF-beta production and numbers of intratumoral Foxp3+ Treg. Eur J Immunol. 39 (5), 1323-1333 (2009).
- El Andaloussi, A., Han, Y., Lesniak, M. S. Prolongation of survival following depletion of CD4 + CD25+ regulatory T cells in mice with experimental brain tumors. J Neurosurg. 105 (3), 430-437 (2006).
- Dinca, E. B., et al. Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy. J. Neurosurg. 107 (3), 610-616 (2007).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Non-parametric estimation from incomplete observations. J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).
- Peto, R., Peto, J. Asymptotically efficient rank invariant procedures. J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185207 (1972).
- Armitage, P., Berry, G., Matthews, J. N. S. . Statistical Methods in Medical Research. , (2001).
- Newcomb, E. W., et al. The combination of ionizing radiation and peripheral vaccination produces long-term survival of mice bearing established invasive GL261 gliomas. Clin Cancer Res. 12 (15), 4730-4737 (2006).
- Pellegatta, S., et al. Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response against malignant gliomas. Cancer Res. 66 (21), 10247-10252 (2006).
- Clark, A. J., et al. Stable luciferase expression does not alter immunologic or in vivo growth properties of GL261 murine glioma cells. J Transl Med. 12, 345-34 (2014).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. J Vis Exp. (57), e3403 (2011).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. J Vis Exp. (41), (2010).
- Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme. J Vis Exp. (67), (2012).
