Spatiotemporele Mapping van Motiliteit in<em> Ex Vivo</em> Bereidingen van de darmen

Institutional Animal Care en gebruik Comite van Virginia Commonwealth University (IACUC) goedgekeurd alle dieren en euthanasie procedures die in dit protocol. 1. Voorbereiding van de Solutions Bereid 4 L Krebs buffer (bestaande uit [mm]: 118 NaCl, 4,75 KCl, 1,19 KH 2PO 4, 1,2 MgSO 4, 2,54 CaCl2, 25 NaHCO 3, 11 glucose). Weeg de geschikte hoeveelheden van elke vaste chemische, in de geschikte hoeveelheid gedeïoniseerd water gebracht en meng met een vortex totdat de oplossing helder is. Vervolgens werd de oplossing met beluchten carboxygen (95% O2, 5% CO2) gedurende 30 minuten onder verwarmen tot 37 ° C. Bepaal de pH van de oplossing, terwijl bij 37 ° C (dezelfde temperatuur als in het orgaanbad) en op pH 7,4 indien nodig met HCl. Houd de Krebs buffer continu carboxygenated en bij 37 ° C gedurende de duur van het experiment. Zettende in- en uitstroom buizen uit de peristaltische pompen in het bufferreservoir en de afslag op de peristaltische pompen perfusie van de buffer te beginnen gedurende de slangen en orgel bad-systeem. OPMERKING: Buffer kunnen in eerste instantie worden gepompt terug in de oorspronkelijke verpakking totdat de toevoeging van ofwel weefsel in het orgel baden of chemicaliën in de perfusie buffer. Dit vermindert de totale hoeveelheid buffer nodig is voor experimenten. Dan moet de uitgaande buffer perfusie lijnen in een lege container worden geplaatst, zodat de ingaande en uitgaande buffers gaan niet samen. Kalibreer de temperatuur van de verwarming van het bad circulatiepomp zodat de buffer binnen de orgaanbaden wordt en blijft 37,0 ± 0,5 ° C gedurende de duur van het experiment. Bevestigen en te passen als nodig, de pH van de Krebs buffer ten minste één keer alvorens weefselsegmenten in het bad in stap 2,8. 2. Voorbereiding van de Weefsels Euthanasereneen cavia door het gebruik van kooldioxide inademing / stikken in een afgesloten kamer of een andere euthanasie methode door de lokale dierlijke zorg en gebruik commissie goedgekeurd. Na bevestiging euthanasie van het dier, opengesneden de buikwand langsrichting met dissectie scharen en zoek de darmen. Snijd het mesenterium bevestigd aan de dunne darm om de blindedarm bloot. OPMERKING: Om te bevestigen euthanasie uitvoeren van een secundaire procedure zoals bilaterale thoracotomie zoals goedgekeurd door een dier zorg en gebruik Comite. Zoek het distale uiteinde van de blindedarm en doorsnijden de proximale colon net distaal van de verbinding met de blindedarm. Doorsnijden dan het proximale colon weer ~ 8 cm distaal van de eerste doorsnijding. Plaats de dikke darm weefsel in verwarmde en carboxygenated Krebs-oplossing (in hoofdstuk 1) voor verdere dissectie. Speld de dikke darm in de dissectie bad en gebruik een kleinere set van de schaar om zoveel mesenterium en vet te verwijderen mogelijk. In het heated dissectie lade, verwijder alle intraluminale inhoud door zachtjes perfusie van Krebs buffer door het lumen met behulp van een injectiespuit gekoppeld aan een stomp uiteinde katheter (om perforatie van het weefsel te voorkomen). Vermijd over-uitzetting van het segment tijdens deze perfusie proces. Verkrijgen twee-fire gepolijste glazen buis katheters (3 mm diameter) en plaats een kort stuk polyethyleen buis (~ 3 mm lang en ~ 3 mm diameter) rond het gedeelte van de glazen buis die het weefsel lumen. Opmerking: Dit zal de hechting rond het weefsel en glazen buis te worden geplaatst om veilig blijven en niet glijden als het preparaat wordt geplaatst in het orgaanbad en tijdens veranderingen in de lengte van het weefsel. Steek een katheter in de mondelinge einde van het weefsel voorbereiding en bind een hechting rond het kleine stuk slang rond de katheter met knoop van een chirurg. Voorzichtig proberen de katheter terug te trekken om ervoor te zorgen de knoop strak. Voer vervolgens dezelfde actie aan de andere katheter invoeren thij aboral einde van het weefsel. Zodra de katheters zijn bevestigd, beweegt het gehele preparaat (tissue plus katheters) vanaf de dissectie lade in een van de orgaanbaden. Plaats het preparaat in het bad met het orale einde afgekeerd van de gebruiker. Volgende mount / zet de glasbuis catheters het orgaanbad met één van de twee voorgestelde methodes. OPMERKING: Bevestiging van de glazen buizen voorkomen weefselsegment het veranderen lengte tijdens het experiment en die boven het maaiveld van de Krebs-buffer in het bad. Optie A: Bevestig het bovenste gedeelte van de glazen buis aan de bovenzijde van de zijde van de plastic orgaanbad met behulp van klei molder of een plastic clip. Optie B: Zet de glazen buizen aan de metalen palen die de camera's boven het orgel bad voorbereiding te houden door het gebruik van plastic clips. Zodra de katheters zijn bevestigd aan het bad sluit een 5-cm stuk slang aan het open einde van iedere katheter. Voor de orale katheter, hechten deze slang aan een 10-ml injectiespuit, die zal worden gebruikt om buffer injecteren in het lumen van de proximale colon segment. Voor de aboral catheter, dit stuk slang kan de luminale uitstroom wordt gericht naar een verzamelhouder (50 ml bekerglas, reservoir, enz.). Met behulp van de injectiespuit bevestigd aan de mondelinge einde, langzaam opgewarmd flush Krebs buffer door het weefsel lumen dat vloeistof door het weefsel stromen te garanderen. Flow wordt bevestigd door vloeistof verlaten van de aboral katheter. Kalibreren van de video-opname-systeem (protocol deel 3), terwijl het weefsel in evenwicht gedurende 30 min. 3. kalibratie van de video-opname-systeem Kalibreren van de camera hoogte plaatsing, video-instellingen voor helderheid en contrast en horizontale afstand met behulp van de software. OPMERKING: De beste instellingen voor intraluminale perfusie opstellingen zijn anders dan de instellingen die worden gebruikt om de snelheid van pellet voortstuwing 13 te bepalen. Click op het tabblad experiment voor de camera te kalibreren. Vervolgens in het menu 'Bestand' klik 'Calibrate.' Zodra de video wordt weergegeven in het venster 'kalibreren werkplek', zet de camera op een hoogte waar het beeld omvat de uiteinden van de katheters ingebracht in het colon lumen. Vervolgens kalibreren van de horizontale afstand gezien in het beeld met behulp van de doorschijnende heerser sticker op elk bad. LET OP: Deze kalibratie is cruciaal om later software berekeningen van de luminale diameter en snelheid van contractiele golven. In hetzelfde venster 'kalibreren werkplek', stelt de rode verticale richtlijnen, zodat ze zijn 10 mm van elkaar volgens de heerser in het camerabeeld. Vervolgens typt u de juiste afstand (10 mm) in het venster 'afstand cursors' en klik op de knop 'CAL'. Vervolgens passen de winst, helderheid, en sluiter schuiven in het venster 'kalibreren werkstation' het imago van de camera, zodat wijzigenhet weefselsegment verschijnt als een donkere silhouet op een lichte achtergrond. OPMERKING: Figuur 4 toont goede en slechte voorbeelden van deze kalibratieprocedure. Goed aan te passen het beeld, ook de focus en diafragma knoppen op de camera zelf aan te passen. Kalibratie is nu voltooid. Klik op 'Opslaan' en klik op 'OK' in het pop-up, en tenslotte klikt u op de 'EXIT' knop. 4. Algemene experimentele procedures Na camera procedures kalibratie en 30 min weefsel verevening zijn voltooid, de naam van de proeven in elke experimentele protocol. Trial namen kunnen worden op basis van de naam en de concentratie van de verbinding en het volume van vloeibare intraluminaal geperfundeerd in het weefselsegment gedurende dat gedeelte van het experiment. Vervolgens afsluiten van de buis uitsteekt uit het aboral katheter door middel van een slangklem. NB: Dit voorkomt luminale vloeistof uit het verlaten van het aboral einde tijdens further experimenten, die het gebruik van bepaalde delen in het lumen om verschillende niveaus van distensie veroorzaken (figuur 1). Injecteren ongeveer 0,7 ml Krebs buffer in de proximale colon lumen genoeg uitzetting naar voortstuwende contracties te starten in de cavia ex vivo preparaat. Opmerking: Dit volume kan enigszins afwijken (0,1 – 0,2 ml) afhankelijk van de totale lengte van het intacte segment en de hoeveelheid rek aangebracht op het segment in het orgaanbad. Zodra het segment is opgezwollen door luminale vloeistof, zet de camera aan en dan noteer de beweeglijkheid voor een vooraf bepaalde periode (bijvoorbeeld 10 min). Specifiek, dubbelklikt u op de toepasselijke naam proef om de experimentele camera te openen en klik vervolgens op de schakelaar naar de "ON" positie om het veld camera bekijken. Klik vervolgens op de opnameknop om de opname te starten (opnameknop wordt rood blijven terwijl de camera is opname) eennd klikt u nogmaals op de opnameknop om de opname te stoppen. Aan het einde van deze eerste controle uitzetting proces, los / verwijder de klem afsluiten aboral de katheter om het weefsel segment naar de distending vloeibare stuwen van het lumen. Na 10 min re-equilibratie periode Herhaal deze procedure met elk van een verscheidenheid aan voedingsstoffen, biologisch actieve middelen, drugs of agonisten / antagonisten in de luminale vloeistof naar de propulsieve beweeglijkheid van het segment (bijvoorbeeld korte keten vetzuren of decaanzuur wijzigen zuur) 10,18. Om gauge helpen wanneer de nieuwe experimentele fluïdum de colon segment laat een luchtbel nabij de haven van de spuit zodat na perfusie van de nieuwe oplossing in het colon lumen de voortgang van de bel kan de gebruiker weten wanneer de experimentele vloeistof heeft het lumen bereikt. Doorgaan intraluminale perfusie met de aboral katheter open tot de luchtbel volledig is geduwd door deluminale perfusie-systeem (kan vereisen 2-3 ml perfusaat). Vervolgens kan de weefselsegment te verdrijven vloeistof door de open aboral catheter tot 5 min. Opmerking: Na deze procedure wordt het lumen een verwaarloosbare hoeveelheid vloeistof bevatten, waarbij perfusie van een bekend volume van vloeistof in het lumen. Opnieuw afsluiten aboral de luminale katheterbuis met een slangklem (zoals in stap 4,3) injecteer dezelfde hoeveelheid distending fluïdum als in de standaard toestand via de injectiespuit. Noteer de motiliteitspatronen gedurende de experimentele periode voor latere analyse en vergelijking met de controle Krebs aandoening (zoals in stap 4,5). Herhaal secties 4,4 – 4,7 van het protocol met verschillende luminale verbindingen of verschillende concentraties van dezelfde luminale verbinding. 5. Bouw van Maps Spatiotemporal (STmaps) Na afloop van het opnemen van het experiment, dubbelklikt u op de naam van een specifiek proces voor de analyse wind openenow voor de bouw van een stmap. Binnen het afspelen van video gebied, het contrast en de helderheid schuifregelaars in de analyse-venster om het beeld geschikt voor analyse te maken (zwart weefsel silhouet op lichte achtergrond; figuur 4). Opmerking: Als de camera kalibratie niet juist is uitgevoerd voor het begin van het experiment wordt de afbeelding kan alleen worden gewijzigd in mindere mate op dit punt. Eenmaal op het beeld in contrast, stel de horizontale en verticale rode richtlijnen binnen het beeld videovenster het weefselgebied te isoleren voor analyse en verwijder gebieden met artefacten. Selecteer ook het juiste moment segment van de registratie door het bepalen van de start- en stoptijd punten voor analyse. Specifiek, selecteert u het begin- en eindpunt in de video met behulp van de groene gele 'B' knoppen 'A' en binnen de analyse software. Stel de schuifregelaar voor tijd tot aan het begin van de video-segment te analyseren en den klik op de groene 'A' knop. Stel vervolgens de schuifbalk naar het einde van het segment te analyseren en klik op de "B" knop geel. Vervolgens klikt u op het tabblad 'motor analyse' om het venster stmap openen en klik op de 'stopwatch' knop. Na het klikken op de stopwatch, naast klikt u op het vizier cursor binnen de zwarte silhouet van het weefsel binnen de opgenomen film te stmap generatie beginnen. Na het klikken op het vizier in het weefsel silhouet, genereert de software en geeft de stmap voor dat gebied van video. NB: Dit kan een paar minuten, afhankelijk van de lengte van de video geselecteerd voor analyse te nemen. Klik op 'zoom' om een ​​vergrote afbeelding van het stmap en controles te bekijken om het beeld aan te passen. Klik op de 'kleur' ​​optie in het nieuw gecreëerde venster om de stmap zien als kleur in plaats van grijstinten. Klik ook op de optie 'Inschakelen' in staat zijn om een ​​cursor op specifieke pixels te plaatsen binnen de kaart en view een tracering van de wijziging in luminale diameter die bepaald weefselgebied. Klik op 'Exit' als u klaar bent. Een stmap voor gebruik exporteren in kranten of presentaties of om verder te analyseren in ImageJ door het selecteren in het menu 'Bestand', gevolgd door 'Export Data' te selecteren en vervolgens 'Meta File'. Noem dan de stmap, die zal worden opgeslagen als een EMF-bestand en klik op de knop 'Opslaan'. Afwisselend beelden van de stmap redden door het vastleggen van een screenshot. Dit is nodig om pseudo-kleur versies van de stmap slaan. 6. Analyse van contractiele golfsnelheid in STmaps Om de snelheid van contractie propagatie of krimp duur analyseren eerst het stmap .emf bestand te converteren naar .tiff, .gif, .jpg of .bmp formaten die aanvaardbaar is voor ImageJ door middel van een bestand conversie programma naar keuze zijn. OPMERKING: ImageJ niet de .emf formaat output van de STmaps van de software te openen. AlternativEly, gebruik screenshot capture software om een ​​foto van een stmap op het scherm te nemen en op te slaan in een geschikt bestandsformaat. Open dan de re-geformatteerde stmap in ImageJ en open de GIMMProcessor plugin door het openen van de "" menu en het selecteren van 'Plugins GIMMProcessor GIMMProcessor' en 'Metingen Table' ramen '. Dit zal zowel open'. Klik op de 'rechthoekige selectie gereedschap' in het venster ImageJ en vervolgens gebruiken om te schetsen door te klikken en het gehele gebied van de schaalaanduiding slepen in de rechterbovenhoek van het stmap. Na die regio is geselecteerd, klikt u op de 'set kalibratie' knop in de plugin. Tot slot plaatst u de juiste afstand (mm) en tijd (sec) in het vak kalibratie volgens de waarden van de schaalaanduiding en klik op 'OK'. Klik vervolgens op de lijntekening instrument in het venster ImageJ. Teken een lijn op het stmap door het midden van een voortplantende krimp langs de hoek van de helling door te klikken en te slepen op het stmap. Afwisselend, trek een verticale lijn door een band van niet-voortplantende contractie contractie duur te bepalen. Na de regel op de juiste wijze wordt getrokken (slechts één lijn kan tegelijk worden getrokken), klikt u op de knop 'nemen de meting in de plugin om een ​​uitlezing van de horizontale afstand, verticale afstand, en de helling van de lijn te genereren; die overeenkomen met respectievelijk de lengte (mm) (sec) en snelheid (mm / sec). Deze gegevens worden weergegeven in het venster 'Metingen Table'. Herhaal de lijntekening en analyse stappen meerdere keren binnen een bepaalde stmap en opslaan van de gegevens als een .gmd bestand. Klik op de knop 'Opslaan' in de plugin en de naam van het bestand. Klik vervolgens op 'Opslaan' opnieuw om het proces te voltooien. Deze gegevens kunnen later worden vergeleken met andere onderzoeksgegevens of gebruikt worden om lijnen tekenen opnieuw op stmap.