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生物学

Cartographie spatio-temporelle de la motilité<em> Ex Vivo</em> Préparation des intestins

Published: January 27, 2016
doi:
10.3791/53263
, ,
1Department of Physiology and Biophysics,Virginia Commonwealth University, 2Department of Biology,Loyola University Maryland

Summary

Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.

Abstract

Plusieurs approches ont été utilisées pour enregistrer et évaluer motilité gastro-intestinale, y compris: l'enregistrement des modifications dans la tension musculaire, la pression intraluminale, et le potentiel de membrane. Toutes ces approches dépendent de mesure de l'activité à un ou plusieurs endroits le long de l'intestin simultanément qui sont ensuite interprétés pour donner une idée des tendances globales de la motilité. Récemment, le développement de la cartographie spatio-temporelle (STmap) techniques d'enregistrement vidéo et ont permis d'observer et d'analyser des modèles complexes en ex vivo des segments entiers de colon et de l'intestin. Une fois enregistré et numérisé, enregistrements vidéo peuvent être convertis en STmaps dans laquelle le diamètre luminal est convertie en niveaux de gris ou [cartes appelé de diamètre (DMAPS)] de couleurs. STmaps peuvent fournir des données sur la direction de la motilité (c.-à-stationnaire, péristaltique, antiperistaltic), la vitesse, la durée, la fréquence et la force des motifs de la motilité contractile. Avantages de cette approche comprennent: analysis interaction ou de développement simultané de différents schémas de la motilité dans différentes régions d'un même segment, de la visualisation de la motilité motif change avec le temps, et l'analyse de la façon dont l'activité dans une région activité influe dans une autre région. Les enregistrements vidéo peuvent être rejouées avec différentes échelles de temps et les paramètres d'analyse de sorte que STmaps distincts et des motifs de la motilité peuvent être analysés plus en détail. Ce protocole détaille notamment les effets de la distension fluide et intraluminaux stimuli intraluminaux qui affectent la génération de la motilité. L'utilisation d'agonistes et antagonistes des récepteurs de luminal fournit des informations sur la façon mécaniste spécifique modèles sont entrepris et sur le modèle ne peut être converti en un autre motif. La technique est limitée par la capacité de mesurer seulement la motilité qui provoque des changements dans le diamètre luminal, sans fournir de données sur les changements de la pression intraluminale ou la tension musculaire, et par la génération d'artefacts sur la base de montage expérimental; bien que, analysis méthodes peuvent tenir compte de ces questions. Par rapport aux techniques antérieures de l'enregistrement vidéo et l'approche STmap fournit une compréhension plus globale de la motilité gastro-intestinale.

Introduction

Différentes méthodes d'enregistrement et d'analyse de la motilité intestinale ont été développés au cours des 150 dernières années 1. Celles-ci vont de la initial in vivo observations et des descriptions de William Beaumont et de Walter Cannon les procédés plus récents de mesure et l'interprétation de l'enregistrement multi-sites de la tension musculaire, la pression intraluminale, et / ou le potentiel membranaire (par exemple, les potentiels de jonction) 2 – 6. Ces dernières approches donnent un aperçu des caractéristiques globales de la motilité, mais sont limitées par le nombre de sites d'enregistrement et de la validité de l'interpolation des données pour les zones entre les sites d'enregistrement.

Le développement récent de la cartographie spatio-temporelle (STmap) techniques d'enregistrement vidéo et ont permis d'observer et d'analyser des modèles de la motilité complexes ex vivo des segments entiers de colon et de l'intestin. Approches initiales, décrites pour la première INTESsegments intestinaux dans la fin des années 1990, 7,8 dépendaient logiciel enquêteur conçu pour analyser l'enregistrement vidéo; plusieurs groupes ont maintenant créé ou des logiciels modifiés à cette fin 2,8 – 12. Alors que de nombreux groupes ont généré leurs propres logiciels ou plug-ins, ils ont tous analysent diamètres d'un segment de tissu et de convertir ces différents diamètres à la représentation en niveaux de gris. Un système d'enregistrement et d'analyse disponibles commercialement appelé le système de surveillance de motilité gastro-intestinale (GIMM) fournit une approche clé en main qui permet d'analyser à la fois la motilité propulsive via fécale détermination de la vitesse de culot dans le cochon de Guinée du côlon distal 13 ainsi que l'analyse des schémas de motilité propulsive et de mélange avec un stimulus fluide dans les segments intestinaux intacts 4,5,14 – 19. Cette dernière approche dépend de la génération et l'analyse des STmaps et est décrite dans le présent document. Le but de cette méthode est d'augmenter til capacité d'analyser qualitativement et quantitativement différents motifs présents dans la motilité de l'intestin. Alors que d'autres groupes ont utilisé la STmap pour l'analyse de la motilité à travers leur propre logiciel, ceci est la première description de la façon d'utiliser le GIMM pour analyser les tendances de la motilité par génération de STmaps. Dans le présent document, nous fournissons des instructions détaillées étape par étape sur: la préparation des tissus intestinaux pour l'enregistrement vidéo, réglage correct des paramètres d'enregistrement vidéo afin de maximiser la capacité de détecter les changements de diamètre des tissus, la création de STmaps, ainsi que la l'interprétation et l'analyse des STmaps en utilisant le système logiciel ImageJ et GIMM.

La méthode décrite ici est spécifique à l'analyse de la perfusion luminale de liquides ou semi-solides contenant des composés qui affectent les schémas de la motilité intestinale. Procédé pour l'analyse des matières fécales de propulsion culot est décrit dans un article de 13 Mawe et ses collègues. Le procédé général décrit ici pourrait êtreappliqué à d'autres organes musculaires tubulaires lisses telles que: le petit intestin, des vaisseaux sanguins, l'urètre, les uretères, etc. Bien que cette méthode à elle seule ne fournit pas de données sur les changements dans la pression ou la tension musculaire, il pourrait être associé à l'utilisation de pression transducteurs, capteurs de force ou des mesures électrophysiologiques de fournir une image plus complète des motifs de la motilité que certains autres groupes ont montré 2,15,20,21.

Protocol

Animaux dans les institutions soin et l'utilisation Comité de la Virginia Commonwealth University (IACUC) a approuvé tous les animaux et les procédures d'euthanasie utilisés dans ce protocole. 1. Préparation des solutions Préparer 4 L de tampon Krebs (composé de [en mm]: 118 NaCl, KCl 4,75, 1,19 KH 2 PO 4, 1.2 MgSO 4, 2,54 CaCl2, 25 NaHCO 3, 11 glucose). Peser les quantités appropriées de chaque produit chimique solide, mis dans le volume approprié d'eau déminéralisée et mélanger à l'aide d'un vortex jusqu'à ce que la solution est claire. Ensuite, aérer la solution avec carboxygen (95% O 2, 5% de CO2) pendant 30 minutes tout en chauffant à 37 ° C. Déterminer le pH de la solution tout à 37 ° C (la même température que dans le bain d'organe) et ajuster le pH à 7,4 en utilisant du HCl si nécessaire. Conserver le tampon Krebs carboxygenated en continu et à 37 ° C pendant toute la durée de l'expérience. Mettreles entrées et sorties des tubes des pompes péristaltiques dans le réservoir tampon et son tour sur les pompes péristaltiques pour commencer la perfusion de la mémoire tampon dans l'ensemble du système de bain tube et orgue. NOTE: Le tampon peut initialement être pompée dans le récipient d'origine jusqu'à ce que l'addition soit de tissu dans les bains d'organes ou de produits chimiques dans le tampon de perfusion. Cela réduit la quantité totale de mémoire tampon requise pour l'expérimentation. Ensuite, les lignes de perfusion tampons sortants devraient être placés dans un récipient vide de sorte que les tampons entrant et sortant ne se mélangent pas. Étalonner la température du système de chauffage sur le thermostat du bain de sorte que le tampon dans les bains d'organes devient et reste 37,0 ± 0,5 ° C pendant toute la durée de l'expérience. Confirmer et modifier si nécessaire, le pH du tampon de Krebs au moins une fois de plus avant de placer segments de tissu dans le bain à l'étape 2.8. 2. Préparation de tissus Euthanasierun cochon de Guinée par l'utilisation de dioxyde de carbone par inhalation / asphyxie dans une chambre étanche ou d'une autre méthode d'euthanasie approuvé par le comité de protection des animaux et l'utilisation locale. Après confirmation de l'euthanasie de l'animal, ouvrir la paroi abdominale longitudinalement avec des ciseaux de dissection et de localiser les intestins. Couper le mésentère attaché à l'intestin grêle pour aider à exposer le caecum. REMARQUE: Pour confirmer l'euthanasie effectuer une procédure secondaire tel thoracotomie bilatérale approuvé par un comité de protection des animaux et l'utilisation. Localiser l'extrémité distale du caecum et le côlon proximal sectionner juste distale par rapport à sa connexion avec le caecum. Puis sectionner le côlon proximal nouveau ~ 8 cm distale à la première dissection transversale. Placez le tissu du côlon dans une solution de Krebs réchauffé et carboxygenated (décrit dans la section 1) pour plus de dissection. Epingler le côlon dans le bain de la dissection et utiliser un plus petit ensemble de ciseaux pour enlever autant mésentère et de graisse que possible. Dans l'heated plateau de dissection, enlever l'ensemble du contenu intraluminal doucement par perfusion de tampon de Krebs à travers la lumière à l'aide d'une seringue couplée à une extrémité cathéter émoussé (pour aider à empêcher la perforation du tissu). Évitez de trop distension du segment au cours de ce processus de perfusion. Obtenir deux cathéters de tubes en verre polies au feu (diamètre de 3 mm) et placez un petit morceau de tube en polyéthylène (~ 3 mm de long et ~ 3 mm de diamètre) autour de la partie du tube de verre entrant dans la lumière de tissus. REMARQUE: Cela permettra à la suture à être placé autour du tube de tissu de verre et de rester en sécurité et ne glisse pas que la préparation est placée dans le bain d'organe et lors des changements de longueur de tissu. Insérez un cathéter dans la fin de la préparation orale de tissu et attacher un fil de suture autour du petit morceau de tube entourant le cathéter en utilisant le noeud d'un chirurgien. Tenter de tirer doucement le cathéter de retour sur pour assurer le nœud est serré. Ensuite, effectuez la même action sur l'autre t cathéter entrantil aboral extrémité du tissu. Une fois que les cathéters sont fixés, déplacer toute la préparation (tissu, plus cathéters) du plateau de dissection dans l'un des bains d'organes. Placer la préparation dans le bain à l'extrémité opposée par voie orale de l'utilisateur. Suivant monter / fixer les cathéters de tube de verre au bain d'organe par une des deux méthodes ont été proposées. NOTE: Fixation du verre des tubes empêcher le segment de tissu changeant de longueur pendant l'expérience ou venir au-dessus du niveau de la mémoire tampon de Krebs dans le bain de surface. Option A: Fixer la partie supérieure du tube de verre au sommet du côté de l'organe de bain en plastique grâce à l'utilisation d'argile de mouleur ou un clip en plastique. Option B: Fixer les tubes de verre à des poteaux métalliques qui maintiennent les appareils ci-dessus de préparation du bain d'organe à l'aide de clips en plastique. Une fois que les cathéters sont fixés sur la baignoire, fixer un morceau de tuyau de 5 cm de l'extrémité ouverte de chaque cathéter. Pour le chat oraleheter, fixer ce tube à une seringue de 10 ml, qui sera utilisée pour injecter tampon dans la lumière du segment du côlon proximal. Par le cathéter aboral, ce morceau de tube permet l'écoulement luminale à être dirigée dans un récipient de collecte (50 ml bécher, réservoir, etc.). Utilisation de la seringue fixée à l'extrémité buccale, rincer lentement réchauffé tampon de Krebs à travers la lumière du tissu de sorte que le liquide peut circuler à travers le tissu. Le débit est confirmée par le liquide sortant aboral cathéter. Calibrer le système d'enregistrement vidéo (section du protocole 3) alors que le tissu se équilibre pendant 30 min. 3. étalonnage du système de vidéo-enregistrement Calibrer le placement de la hauteur de la caméra, les paramètres vidéo pour luminosité et le contraste, et la distance horizontale en utilisant le logiciel. NOTE: Les meilleurs réglages pour les configurations de perfusion intraluminaux sont différents que les paramètres utilisés pour déterminer la vitesse de propulsion 13 culot. Click sur l'onglet de l'expérience pour la caméra à étalonner. Ensuite, dans le menu «Fichier» cliquez sur «Calibrer». Une fois la vidéo apparaît dans la fenêtre «calibrer poste de travail ', régler l'appareil à une hauteur où l'image comprend les extrémités des cathéters insérés dans la lumière colique. Ensuite, calibrer la distance horizontale vu dans l'image en utilisant l'autocollant de la règle translucide attachée à chaque bain. NOTE: Ce calibrage est crucial pour les calculs de logiciels ultérieures de diamètre luminal et la vitesse des ondes de contraction. Dans la même fenêtre 'étalonnage de poste de travail », établir les lignes directrices verticales rouges alors qu'ils sont 10 mm de distance selon la règle de l'image de la caméra. Ensuite, tapez la distance appropriée (10 mm) dans la fenêtre «curseurs de distance» et cliquez sur le bouton «CAL». Ensuite, régler le gain, la luminosité et l'obturateur curseurs dans la fenêtre «calibrer poste de travail» pour modifier l'image de la caméra de sorte quele segment de tissu apparaît comme une silhouette sombre sur un fond clair. REMARQUE: La figure 4 montre bons et mauvais exemples de cette procédure d'étalonnage. Pour régler correctement l'image, réglez aussi l'objet et de l'ouverture des boutons sur l'appareil lui-même. L'étalonnage est maintenant terminée. Cliquez sur "Enregistrer", puis cliquez sur «OK» dans la fenêtre pop-up, et enfin cliquez sur le bouton «EXIT». 4. Procédures général expérimentales Après les procédures d'étalonnage de l'appareil photo et 30 min de l'équilibration des tissus sont complets, nommer les essais dans chaque protocole expérimental. Les noms d'essais peuvent être basés sur le nom et la concentration du composé et du volume de liquide perfusé par voie intraluminale dans le segment de tissu au cours de cette partie de l'expérience. Ensuite, occlure le tube faisant saillie à partir du cathéter aboral par l'utilisation d'un collier de serrage de tuyau. NOTE: Ce empêche le liquide luminal de sortir de la fin aboral cours fucomplémen taires expérimentation, ce qui permet l'utilisation de volumes spécifiques dans la lumière pour provoquer différents niveaux de distension (Figure 1). Injecter environ 0,7 ml de tampon Krebs dans la lumière du côlon proximal de fournir suffisamment de distension pour initier les contractions propulsives dans le cochon de Guinée ex vivo de préparation. Remarque: Ce volume peut varier légèrement (0,1 – 0,2 ml) en fonction de la longueur totale du segment intact et la quantité d'étirement appliquée au segment dans le bain d'organe. Une fois que le segment est distendu par le fluide luminal, allumer l'appareil photo, puis enregistrer la motilité pour une période prédéterminée de temps (par exemple, 10 min). Plus précisément, double-cliquez sur le procès bien nommé pour ouvrir la vue de la caméra expérimentale et puis cliquez sur l'interrupteur à bascule en position «ON» pour afficher le champ de la caméra. Ensuite, cliquez sur le bouton d'enregistrement pour lancer l'enregistrement (bouton d'enregistrement restera rouge pendant l'enregistrement est) unnd cliquez à nouveau sur le bouton d'enregistrement pour arrêter l'enregistrement. À la fin de ce premier essai de distension de commande, desserrer / enlever le collier d'occlusion du cathéter aboral pour permettre au segment de tissu pour propulser le liquide de distension de la lumière. Après une période de ré-équilibrage 10 min, répéter cette procédure avec une quelconque d'une variété de nutriments, les agents bioactifs, les médicaments, ou des agonistes / antagonistes du fluide luminal de modifier la motilité propulsive du segment (par exemple, les acides gras à chaîne courte ou décanoïque l'acide) 10,18. Pour permettre de mesurer si le nouveau fluide expérimentale entre le segment du côlon, laisser une bulle d'air à proximité du port de la seringue de sorte que lors perfusion de la nouvelle solution dans le côlon lumière les progrès de la bulle permettra à l'utilisateur de savoir quand le fluide expérimentale a atteint la lumière. Continuer perfusion intraluminale avec le cathéter aboral ouverte jusqu'à ce que la bulle a été poussé complètement à travers lasystème de perfusion luminale (peut nécessiter 2-3 ml de liquide de perfusion). Ensuite, laisser le segment de tissu pour expulser le fluide à travers le cathéter aboral ouvert pour un maximum de 5 min. REMARQUE: Après cette procédure, la lumière contient un volume négligeable de fluide, ce qui permet la perfusion d'un volume connu de liquide dans la lumière. Re-occlure le tube de cathéter luminale aboral aide d'une pince pour tuyau (comme à l'étape 4.3) injecter le même volume de fluide de distension dans la condition de commande à travers la seringue. Enregistrer les schémas de la motilité au cours de la période expérimentale pour une analyse ultérieure et comparaison avec le témoin état Krebs (comme à l'étape 4.5). Répétez les sections 4.4 – 4.7 du protocole avec différents composés luminal ou des concentrations différentes du même composé luminale. 5. construction de cartes spatiotemporels (STmaps) Après l'achèvement de l'enregistrement de l'expérience, double-cliquez sur le nom d'un essai spécifique pour ouvrir l'analyse ventux pour la construction d'un STmap. Dans la zone de lecture vidéo, ajuster les curseurs contraste et la luminosité dans la fenêtre d'analyse pour rendre l'image appropriée pour l'analyse (silhouette de tissu noir sur fond clair; Figure 4). NOTE: Si l'étalonnage de l'appareil photo n'a pas été effectuée de manière appropriée avant de commencer l'expérience de l'image ne peut être modifié dans une moindre mesure à ce stade. Une fois que l'image est contrastée correctement, établir les lignes directrices horizontales et verticales rouges dans la fenêtre d'image vidéo pour isoler la région de tissu pour l'analyse et supprimer les zones contenant des artefacts. Aussi, sélectionner le segment de temps approprié de l'enregistrement par la détermination du début et de fin des points de temps pour l'analyse. Plus précisément, sélectionner le départ et le point final dans la vidéo en utilisant les boutons jaunes 'B' verte 'A' et dans le logiciel d'analyse. Réglez l'heure curseur vers le début du segment vidéo à analyser et len cliquez sur le 'A' bouton vert. Ensuite, placez le curseur à la fin du segment à analyser et cliquez sur le bouton jaune «B». Ensuite, cliquez sur l'onglet «d'analyse du moteur 'pour ouvrir la fenêtre STmap et cliquez sur le bouton« chronomètre ». Après avoir cliqué sur le chronomètre, à côté cliquez sur le réticule au sein de la silhouette noire du tissu dans le film enregistré pour lancer la génération STmap. Après avoir cliqué sur la ligne de mire dans la silhouette de tissu, le logiciel génère et affiche le STmap pour cette région de la vidéo. NOTE: Cela peut prendre quelques minutes en fonction de la longueur de la vidéo sélectionnée pour l'analyse. Cliquez sur 'zoom' pour voir une image agrandie de la STmap et des contrôles pour ajuster l'image. Cliquez sur l'option «couleur» dans la fenêtre nouvellement créé pour afficher l'STmap que la couleur à la place de niveaux de gris. En outre, cliquez sur l'option «Activer» pour être en mesure de placer un curseur sur des pixels spécifiques dans la carte et vIEW un tracé de la variation du diamètre luminal de la région spécifique d'un tissu. Cliquez sur 'Exit' lorsque vous avez terminé. Exporter une STmap pour une utilisation dans des documents ou des présentations ou d'analyser plus en ImageJ en sélectionnant le menu «Fichier», puis en sélectionnant «Exporter des données», puis «Meta File '. Puis nommez le STmap, qui sera enregistrée dans un fichier .emf et cliquez sur le bouton «Enregistrer». Alternativement, enregistrer des images de la STmap en capturant une capture d'écran. Cela est nécessaire pour enregistrer des versions pseudo-couleurs de la STmap. 6. Analyse des contractile vitesse de l'onde dans STmaps Pour analyser la vitesse de propagation de contraction ou de la durée de la contraction, d'abord convertir le dossier de l'STmap à .tiff, .gif, .jpg, .bmp ou formats qui sont acceptables pour imagej grâce à un programme de conversion de fichier de choix. REMARQUE: ImageJ ne pas ouvrir la sortie de format .emf des STmaps à partir du logiciel. AlternativEly, utiliser un logiciel de captures d'écran pour prendre une photo d'un STmap sur l'écran et l'enregistrer dans un format de fichier approprié. Ensuite, ouvrez le STmap reformatée dans ImageJ, puis ouvrir le plugin GIMMProcessor en ouvrant le menu 'et en sélectionnant "Plugins GIMMProcessor'. Cela va ouvrir deux« fenêtres GIMMProcessor »et« Mesures table '. Cliquez sur l''outil de sélection rectangulaire »dans la fenêtre ImageJ et ensuite l'utiliser pour décrire en cliquant et glissant l'ensemble de la zone de la barre d'échelle dans le coin supérieur droit de la STmap. Après cette région est sélectionnée, cliquez sur le bouton «calibrage» dans le plugin. Enfin, insérez la distance appropriée (mm) et l'heure (s) dans la boîte de calibrage selon les valeurs sur l'échelle graphique et cliquez sur «Terminé». Ensuite, cliquez sur l'outil de dessin de ligne dans la fenêtre ImageJ. Tracez une ligne sur le STmap par le centre d'une contraction de multiplication selon l'angle de ee pente en cliquant et glissant sur l'image STmap. Alternativement, tracez une ligne verticale à travers une bande de non-propagation contraction de déterminer la durée de la contraction. Après la ligne est tracée de manière appropriée (une seule ligne peut être tirée à la fois), cliquez sur le bouton «prendre la mesure» dans le plugin pour générer une sortie de lire de la distance horizontale, distance verticale, et la pente de la ligne; qui correspond à la longueur (mm), le temps (en secondes) et la vitesse (mm / sec), respectivement. Ces données sont affichées dans la fenêtre «Mesures de la table '. Répétez le dessin de la ligne et l'analyse étapes plusieurs fois dans une STmap donné et enregistrer les données dans un fichier .gmd. Cliquez sur le bouton "Enregistrer" dans le plugin et nommez le fichier. Puis cliquez sur «Enregistrer» pour terminer le processus. Ces données peuvent ensuite être comparés avec d'autres données de l'essai ou utilisés pour redessiner les lignes sur une STmap.

Representative Results

Comprendre Plans spatiotemporels (STmaps) que le diamètre Maps (DMAPS) Bien que les cartes générées par cette technique sont spatio-temporelle, les changements dans le diamètre luminal du tissu est le paramètre visualisé spécifiquement à la fois la distance et du temps. Le STmap représente la distance horizontale le long du segment de tissu sur l'axe des x (en mm) et le temps sur l'axe des ordonnées (à sec) avec l'heure de début supérieure à l'heure et se terminant à la base. Dans le coin supérieur droit est une légende, qui affiche un diamètre luminal minimales et maximales ainsi que mise à l'échelle à la fois X et Y-axes (figures 1-4). Ainsi, les différentes nuances de pixels dans l'image en niveaux de gris correspondent à différents diamètres luminal. Sombres pixels correspondent à des diamètres plus larges et les pixels clairs correspondent à des diamètres plus petits. Ainsi, les ondes contractiles du muscle circulaire apparaîtront en tant que régions de pixellisation plus léger en raison de la réduction du diamètre luminal ( <strong> Figure 1 Les flèches noires). En revanche, en raison de distension luminale relaxation du muscle circulaire ou une grande bolus de fluide provoque une augmentation du diamètre luminal et dans les pixels les plus sombres (flèches blanches Figure 1C) STmap / DMAP. Une autre discussion de la formation et le sens de STmaps peut être trouvé dans un article de groupe Lammers 11. Contractions de multiplication Luminal distension-induites Sur la figure 1, Guinée porc côlon proximal a été distendu par 0,5, 1,0, 1,5, et 2,0 ml de tampon de Krebs pendant 5 minutes à chaque volume. Contractions de multiplication ont été provoquées par tous les volumes ≥1.0 ml et apparaissent sous forme de fines bandes blanches dans le STmap (Figure 1). Distension de la lumière intestinale provoque le déclenchement des contractions de propagation. Comme le montre la Figure 1, le diamètre de la lumière augmente avec l'augmentation des volumes intraluminaux et les pixels dans la STmapcorrespondant à son diamètre de foncer la création d'un contexte général plus sombre. À un certain niveau de distension du réflexe péristaltique est activée (1,0 ml; figure 1), qui déclenche ondes propulsives de contraction à la fin par voie orale qui diminuent le diamètre de la lumière et se déplacent vers l'extrémité anale du segment (disponible en tant que bandes blanches sur les figures 1 et 4). Le blanc contraction bande représentant est souvent précédée par une bande sombre, qui représente la relaxation aboral avant de l'onde péristaltique (flèches blanches Figure 1C). Ces pixels blancs et noirs correspondent à la contraction de composants ascendants et descendants de relaxation du réflexe péristaltique, respectivement 22,23. Dans le STmap la figure 1 panneau A, il ya 0 ondes propulsives à 0,0 ml, 0 ondes propulsives à 0,5 ml distension, 3 vagues de propulsion à 1,0 ml distension, 6 vagues de propulsion à 1,5 ml distension, et 5 vagues de propulsion d'unt 2,0 ml distension. Les contractions stationnaires / mélange de nutriments induit Vagues de propager la contraction ne sont pas le seul motif de la motilité qui peut être visualisé par STmaps. Mélange des motifs de la motilité telles que la segmentation peuvent également être vu dans STmaps et l'image correspondante (figure 2A). Ce modèle est différent de propagation des contractions. Pendant le mélange de nombreux petits patrons, des contractions stationnaires se produisent dans différents domaines en même temps (visualisés comme de multiples petits carrés blancs dans la même ligne horizontale, mais ne touchant pas l'autre). Bien que chaque contraction segmentaire est fixe et ne se déplace pas dans la voie orale pour manière anale tel que décrit pour les contractions de propagation, de la capacité des STmaps à illustrer les modes de contractiles complexes sur des périodes plus longues permet la visualisation de la progression lente de contractions anale au cours du temps (figure 2A flèche noire). La durée dechaque contraction individu peut également être déterminée en traçant une ligne verticale passant par la place de la contraction des blancs en utilisant ImageJ et le plugin associé (figure 2A). Dans ce STmap notamment généré par perfusion intra-colique des acides gras à chaîne courte, la durée moyenne de contraction stationnaire est ~ 2 sec (gamme: 1,9 à 2,1 sec). Bien que mésentère restant sur ​​un segment de tissu peut provoquer des artefacts dans l'analyse, les artefacts verticaux de lignes générés par le mésentère (figures 1B, 2B) peuvent être utilisés pour déterminer les mouvements musculaires longitudinales. Dans les figures 1B et 2B le mouvement horizontal de la ligne verticale noire est due à la contraction et la relaxation du muscle longitudinal. Ce mouvement latéral du muscle longitudinal peut être visualisée sur STmaps que les mouvements horizontaux des bandes verticales générées par des artefacts de mésentère (figures 1B, 2B). ImageJ et Plugin Analyse des STmaps Tant la vitesse d'une onde de propagation (figure 3) ainsi que la durée de contraction (figure 2) peut être déterminée en utilisant ImageJ et le greffon GIMMProcessor. Dans la figure 3, la vitesse de propagation des deux orthograde et rétrogrades vagues était ~ 0,25 mm / sec (gamme: de 0,21 à 0,35 mm / sec). Comme on peut le voir dans l'image vidéo au-dessus de la carte ST, les lignes d'analyse (lignes rouges formant une zone sur l'image vidéo) ont été fixés avec précision autour d'un bord du segment de tissu à la place de l'ordre de l'ensemble du segment. Ceci est une utilisation importante des lignes directrices dans le logiciel. Réglage précis de ces directives est cruciale pour une analyse correcte de la vidéo analysée comme plus loin dans la section de discussion. Ceci permet la génération d'un STmap qui visualise contractions ondulation 24 myogéniques. Ces contractions sont myogénique d'origine et ne changent pas le diamètre luminal grandement. Aussi, dir différenteexions de propagation (orthograde ou rétrogrades), qui sont communs pour les ondulations, peuvent être analysées à l'aide de cette technique (Figure 3). Comme le montre la figure 2, la durée de contraction peut varier dans différentes régions du segment de tissu. Bonne analyse de STmaps Un problème potentiel avec la création de STmaps est possible génération de artefact dû à la méthodologie expérimentale. Par exemple, mésentère gauche sur l'extérieur du tissu va augmenter le diamètre de lecture pour ce segment du tissu créant une ligne noire verticale sur le STmap (figures 1, 2B). La présence de mésentère élargit aussi artificiellement la carte en niveaux de gris en augmentant mesure luminale la plus large, qui se traduit par un émoussement des mesures de contraste de l'échelle. Pour cette raison, il est préférable d'enlever le mésentère aussi complètement que possible à partir du segment sans perforer le tissu. Un autre possible artefact STmap est une ligne verticale blanche en raison de bulles dans le liquide luminal qui ne peuvent être contrastées au noir (figure 4B). Ces bulles peuvent rendre le diamètre luminal apparaître plus petit au logiciel d'analyse ou de superposer plusieurs régions blanc / lumière sur les motifs de la motilité dans le STmap. Par conséquent, la configuration du segment de tissu et le bon contraste de l'enregistrement vidéo avant l'analyse est absolument essentielle à la réussite dans la construction STmaps (Figure 4). Configurations contrastées corrects et incorrects sont présentés dans la figure 4. Il est important de noter que l'ajustement de la vidéo à la fois dans l'appareil de pré-expérience étalonnage et post-expérience fenêtre d'analyse sont indispensables à la production d'STmap et d'analyse appropriées. Calibrage d'image incorrecte peut conduire à STmaps avec des données inutilisables (figure 4A). 700 "/> Figure 1. ondes se propageant dans le côlon proximal. (A) de la courbe distension-réponse (réalisée en Guinée cochon côlon proximal) a été utilisé pour déterminer le volume de fluide intraluminal opportun d'engager la propagation d'ondes dans ce segment (bandes horizontales blanches). Les flèches noires illustrent des exemples de vagues se propageant pleine longueur. Les flèches blanches illustrent l'artefact de ligne causée par une élimination incomplète de mésentère. (B) Une vue rapprochée de propager contractions obtenus par la génération STmap d'une expérience similaire à Panel A, mais une vidéo de plus courte durée. Il est plus facile de noter que les progrès dans les contractions orale à la direction anal et d'identifier la précédente détente aboral représentée comme une zone sombre de l'avant de la bande blanche par rapport au panneau A. Cette carte fournit également une autre vue d'artefacts de mesentery. La boîte rouge identifie la région de cette STmap élargi dans le Panneau de C (C) Ce panneau illustre une vue encore plus proche of la même vidéo et la carte comme dans les écrans flèches B. blancs marqués point »de distension fluide» aux pixels sombres qui sont dues à la distension par un fluide luminal aboral à l'onde de propagation. Ce sont des régions où la détente circulaire musculaire se produit à aboral circulaire contraction musculaire. Notez que les contractions se propageant ressemblent lignes horizontales complètement dans le panneau A cause de la longue échelle de temps de la carte. Dans les panneaux B et C, le temps échelles sont progressivement plus court de telle sorte que la vague de contraction a une pente qui peut être mesuré et rapporté que la vitesse du mouvement des vagues. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2. Détermination de contraction Durée par STmap. (A) Guinée cochon proximale du colon shux un motif de la motilité de mélange / segmentaire en réponse à une perfusion de courte intraluminal acide gras de chaîne (butyrate). Lignes rouges verticales ont été établis à travers les périodes de contraction de déterminer la durée de la contraction en utilisant Image J et le plugin GIMMProcessor. La flèche noire indique la direction aboral de propagation des contractions stationnaires. (B) contractions se propageant dans l'iléon de souris montrent souvent des régions de contraction soutenue. Les flèches verticales tracées sur cette carte montrent que les régions plus orales restés contractés pour une durée plus longue. Dans cette préparation, l'extrémité anale de la préparation a été fermée pour empêcher le fluide de quitter le système fermé pendant les contractions tissulaires. L'image en haut du panneau montre un moment où la fin orale ensemble du tissu est contracté (blanc sur STmap), tandis que toute l'extrémité anale est distendu par fluide (noir sur STmap). Le mouvement horizontal / latéral de la verticale noire dans le milieu de la partie B STmap mouvement de la montrecouche musculaire longitudinale. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3. Patterns bi-directionnel de la motilité. Propagation des ondes peuvent se déplacer dans les deux orthograde (oral anal) et rétrograde (anale orale) directions. Flèches noires solides montrent la propagation de orthograde normale et flèches noires en pointillés montrent la propagation rétrograde. La vitesse de propagation des deux orthograde et contractions rétrogrades en ce STmap ont été déterminées par analyse ImageJ et étaient ~ 0,25 mm / s. Lignes d'analyse d'images (lignes rouges formant une boîte sur l'image vidéo au-dessus du STmap) ont été mis en près d'un bord du tissu pour visualiser contractions myogéniques d'ondulation qui sont faible amplitude, contractions peu profondes souvent orientés dans orthograde, retrograde, ou les deux directions. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4. importance d'une bonne contraste d'image pour STmap génération. (A) montre une image contrastée et STmap mal, tandis que le panneau B montre une image bien contrastée et STmap. Dans (A) les bandes blanches horizontales générées à partir de l'image bien contrastée (B) ne sont pas aussi évident et il ya des objets multiples (ombrage blanc) en raison de l'image initiale étant en niveaux de gris. Dans le STmap généré à partir de l'image bien contrastée (B) les objets d'ombrage blanc de l'échelle de gris disparaissent et les ondes de propagation sont plus prononcés. En outre, l'ombrage noir représentant la relaxation ahEAD de l'onde se propageant contractile peut être vu dans la fin anale du STmap à chaque vague de contraction. Dans le panneau B, les flèches blanches illustrent un artefact STmap générée par une région de l'image qui pourrait ne pas être correctement contrastée. Ce type d'artefact est principalement due à des bulles qui se produisent occasionnellement intraluminales dans la préparation en cours du protocole expérimental. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Motilité intestinale a été vu et décrit un certain nombre de perspectives fondées sur la nature des paramètres étant enregistrés. L'enregistrement vidéo et la cartographie spatio-temporelle a prouvé un outil précieux qui permet d'analyser le mouvement d'ensemble et / ou de propulsion plus longs segments de l'intestin ainsi que l'analyse de l'activité à des points spécifiques le long du segment. L'approche adoptée pour l'enregistrement vidéo et la cartographie spatio-temporelle peut être double et est le reflet de la région examinée et de la nature du contenu luminal. Dans segments intestinaux où contenu luminal plus fluide et dans le côlon proximal où son contenu sont plus semi-solide, l'activité est induite par l'introduction d'un fluide intraluminal de bolus ou perfusion. Cartes spatio-temporelles en ces enregistrements vidéo sont conçues pour représenter le mouvement de l'ensemble du segment, comme décrit ci-dessus. En revanche, dans le milieu à la partie distale du côlon où les contenus sont plus solides, l'activité est initiée par l'insertion d'une pelle fécalet (pastille revêtue époxy naturel ou artificiel pastille) et des cartes spatio-temporels sont conçues pour refléter le déplacement de la pastille à travers le côlon, comme illustré dans l'article de JOVE Hoffman et al. 13. Ainsi, la configuration de l'expérience et de l'analyse sont cruciales et dépendent du type de stimulus et de la région étudiée. Par conséquent, les étapes essentielles pour la production et l'analyse des cartes spatio-temporelle des induite fluide motilité intestinale sont: 1) l'élimination correcte des mésentère du tissu disséqué; 2) l'image calibrage correct avant l'enregistrement; 3) l'élimination correcte des objets lors de la génération et l'analyse STmap; 4) proprement dite de l'installation du système d'analyse; et 5) gagner la dextérité manuelle pour sonder et suturer les segments sans les endommager.

Alors que l'utilisation de STmaps de diamètre luminal ont amélioré la capacité de visualiser et d'analyser les tendances de la motilité complètes sur une région de l'intestin, la technique est utilisé au mieux lorsqu'il est couplé avecmesures fonctionnelles de pression ou de la contraction musculaire 2,15,20. Par exemple, alors que certains des contractions musculaires peuvent changer diamètre luminal légèrement et être visible sur certains STmaps (ie, ondulations myogéniques), ils ne peuvent pas réellement causer de propulsion ou de mélange du contenu intestinal 25. Cela ne peut pas être connu sans couplage de cette technique à d'autres mesures fonctionnelles. En outre, la nature de nombreuses préparations de tissu dans ce type de système (à savoir, un système de perfusion luminale fermée ou luminal constante par un système de pompe) conduit à des artefacts au sein STmaps. Ainsi, l'utilisateur doit être conscient de la façon dont la préparation de leur organe spécifique et l'expérience peuvent conduire à des artefacts dans les données et les moyens d'éviter ou exclure ces artefacts dans l'analyse de données (par exemple, des lignes verticales induite mesentery-ou pixellisation sombre à cause de l'incapacité du tissu à expulser le fluide à partir du système dans une préparation luminale fermé). Il existe plusieurs méthodes pour perfusion luminale d'un danstact segment intestinal outre un système fermé. Une méthode consiste à utiliser à la place un système ouvert qui maintient une pression constante intraluminal / arrière par le biais d'un tube en relief et / ou une soupape à sens unique à l'extrémité anale de la préparation 8-10,30. Cela permet au fluide de sortir de la préparation pendant les contractions propulsives.

Comme le système est configuré principalement pour détecter les changements de diamètre luminal, ces contractions ou des motifs de la motilité qui ne touchent pas beaucoup diamètre luminal sont souvent difficiles à visualiser par ce protocole. Étant donné que les changements dans l'ombrage des pixels à l'intérieur de la STmap sont basées sur des changements de diamètre luminal, les schémas de la motilité qui ne causent pas de grandes variations de diamètre ne sont pas bien visualisées dans cette méthode si fortes contractions sont également présents dans la même enregistrement. Comme décrit pour la visualisation et l'analyse de type ondulation contraction (Figure 3), fixer les lignes d'analyse dans la vidéo d'enregistrement plus proche to la paroi tissulaire peut éviter ce problème. Cette méthode réduit le diamètre maximal affichée dans le STmap, afin contractions qui changent que très peu diamètre de tissus peuvent être visualisées. Une autre option pour résoudre ce problème est en train de changer la durée du segment vidéo analysé, pour exclure les contractions qui affectent grandement diamètre luminal, afin que les petites contractions sont plus facilement visualisés. Ceci conduit au problème potentiel de la motilité qui change peu diamètre luminal recherche similaire à un STmap séparée où les contractions ont changé considérablement diamètre luminal. En effet, la détermination des pixels blancs sur la carte est basé sur le plus petit diamètre dans une vidéo donnée. Si il n'y a pas beaucoup de variabilité de diamètre dans la vidéo (peu ou pas de contraction du muscle circulaire) de très petites contractions qui ne changent pas le diamètre de la préparation peut grandement ressembler à contractions péristaltiques d'une autre vidéo. Par conséquent, il est important de considérer la figurelégende dans le coin supérieur droit de la carte. Si la différence entre les diamètres maximum et minimum est petit, il est important de comparer la STmap à la vidéo, il a été généré à partir de déterminer la validité de la variation de teinte de pixel représentée dans le STmap. Ainsi, l'examen de la barre d'échelle en collaboration avec l'enregistrement réel est essentiel pour corriger l'interprétation de la carte.

L'enregistrement vidéo et la cartographie spatio-temporelle des segments intestinaux et du côlon ont été appliquées à une variété d'espèces, y compris le poisson zèbre 26, souris 25,27 – 30, rat 7,9,30 – 33, cochon Guinée 5,6,8,13 – 19, 24,30,32,34,35, trichosurus 12,36, 2,30,37,38 lapin, poulet 39, cochon 40,41 et humain 42. Les espèces les plus étudiés est le cochon de Guinée. Cela ne veut pas surprenant parce que le cochon de Guinée système nerveux entérique hcomme cela a été le plus complètement caractérisé et historiquement, il a été l'animal le plus étudié in vitro à l'égard de la motilité propulsive de l'intestin 43. Cartographie spatio-temporelle a été appliquée à la plupart des segments de l'intestin tubulaires de petits animaux; cependant, des études dans les systèmes modifiés à l'aide de lapin et le porc démontrent l'application de cette méthode à de plus grands animaux. Dans le cas du lapin, la méthode est identique à celle de petits animaux, à l'exception que des segments plus larges et des bains d'organes ont été utilisés 30. L'approche utilisée dans le cochon était d'utiliser une boucle extériorisée de l'intestin d'un porc anesthésié plutôt que l'immersion d'un segment de tissu disséqué dans un bain d'organe. En outre, STmaps ont été générés par corrélation croisée au lieu de la méthode de transillumination utilisé dans la plupart des études 40. La, préparation isolée de la boucle vasculairement perfusé pour l'enregistrement vidéo et la cartographie spatio-temporelle a également été appliquée à de plus petites espèces comme le rat <sup> 33. Une étude récente de Kuizenga et al. est la première utilisation de STmaps de la vidéo enregistrée motifs de la motilité ex vivo segments de l'intestin humain 42; bien que, STmapping approches ont été appliqués à l'analyse de la pression manométrique (enregistrements) chez l'homme in vivo 3,44. Les schémas de la motilité enregistrées dans les tissus humains sont similaires à celles déjà enregistrées dans des modèles animaux en utilisant des techniques similaires et valider l'extension de cette approche pour les tissus humains. Il est à noter que cette étude STmaps combinés proviennent d'enregistrements vidéo avec mesure de la contraction musculaire enregistrée par les capteurs de force. Mesure de la pression intraluminale par un cathéter manométrique de fibre optique inséré dans le segment ex vivo a été également converti en un STmap, qui montre la polyvalence du STmap de visualiser plus de variations de diamètre luminal. Cette approche combinée de traction musculaire corrélation, la pression intraluminale et le mouvement de la paroi permetpour une analyse fonctionnelle plus approfondie des STmaps générés à partir de l'enregistrement vidéo.

Études de STmaps générés par les mouvements de la paroi et les changements de diamètre luminal (également appelé DMAPS) ont permis à des descriptions détaillées des modèles de la motilité tels que les vagues péristaltiques propulsives et des contractions segmentaires localisés. Bien que ces modèles ont été identifiés par des méthodes expérimentales antérieures, l'approche actuelle permet une définition plus précise des mouvements contractiles localisées telles que des ondulations et des contractions péristaltiques nouveaux anti-9,24,25,30,31,42. La construction de STmaps et l'analyse des changements dans le profil de la motilité ont été appliquées à des questions clés de la motilité gastro-intestinale de l'intestin et du côlon. Ceux-ci comprennent: la différenciation des contractions neurogènes et myogènes et de définir le rôle des cellules interstitielles de Cajal 6,9,11,12,16,24,26,27,29 – 31,33,37 – 40,42, la compréhension de la complexitéinteractions entre les couches musculaires longitudinales et circulaires 2,7,8,11,12,32,39,40, examinant les effets de nutriments intraluminaux 10,18,19, 34 souches microbiennes, et les viscosités 12,36 sur divers modèles de la motilité, et de comprendre le rôle des divers agents neurohormonales endogènes et exogènes agents pharmacologiques 2,4 – 7,9,10,13 – 17,28,35,40 dans la génération et la modification de la motilité. L'avenir de cette technique consiste à coupler avec d'autres mesures, y compris la pression, l'électrophysiologie et la tension / contractilité. Des études récentes ont souvent incorporées une ou plusieurs de ces mesures en liaison avec l'enregistrement vidéo et la cartographie spatio-temporel pour fournir des détails supplémentaires corrélatifs 2,42. En outre, le système peut être utilisé pour mesurer la motilité dans d'autres organes tubulaires et non tubulaires. Par exemple, des tentatives ont été faites à l'aide de la mesure de la motilité gastriqueun tel système, mais la technique et les logiciels ont besoin de raffinement pour mieux quantifier la motilité dans un tel organe non tubulaire 45. Il ne fait aucun doute que l'utilisation de techniques de cartographie spatio-temporelles seul et en combinaison avec des méthodes plus traditionnelles d'analyse conduira à une plus approfondie et la compréhension complète de motilité gastro-intestinale à l'avenir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DMK a été soutenu par une subvention de IRACDA NIGMS (K12GM093857) à la Virginia Commonwealth University. Ce travail a été soutenu par NIDDKD subvention DK34153 à John R. Grider.

Materials

Sodium Chloride (NaCl) Fisher BP358 For Krebs buffer.
Potassium Chloride (KCl) Fisher BP366 For Krebs buffer.
Potassium Phosphate (KH2PO4) Fisher P285 For Krebs buffer.
Magnesium Sulfate (MgSO4) Sigma M2643 For Krebs buffer.
Calcium Chloride (CaCl2) Sigma C7902 For Krebs buffer.
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Fisher BP328 For Krebs buffer.
Glucose Sigma G7021 For Krebs buffer.
Carboxygen (95%O2/5%CO2)
Dissecting pins
Dissecting trays/dishes
Dunkin Hartley Guinea Pigs Charles River Strain 051
ImageJ http://imagej.nih.gov/ij/ Freely available online.
GastroIntestinal Motility Monitor (GIMM) Catamount Inc., St. Albans, Vermont Includes parts listed below.
Peristaltic Pumps Included with GIMM.
Bath Cameras Included with GIMM.
Bath TransIllumination Backlights Included with GIMM.
Organ Baths Included with GIMM.
Backlight Intensity Controls Included with GIMM.
GIMM Processor ImageJ Plugin Included with GIMM.
Polyethylene Tubing Included with GIMM.
Tubing Connectors Included with GIMM.
Masterflex tubing for Peristaltic Pumps Included with GIMM.
Heating Bath/Water Circulator Included with GIMM.
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Kendig, D. M., Hurst, N. R., Grider, J. R. Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines. J. Vis. Exp. (107), e53263, doi:10.3791/53263 (2016).
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