대장 줄기 세포 돌연변이의 정량화
Summary
We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.
Abstract
줄기 세포의 돌연변이를 측정 할 수있는 능력은, 화학 물질은 잠재적으로 암을 초래할 돌연변이를 유도 할 수 있다면, 어느 정도에 중요한 세포 집단의 정량화 할 수있는 강력한 도구이다. 상기 X 연결된 글루코스 -6- 포스페이트 탈수소 효소 유전자의 줄기 세포 돌연변이를 정량화하기 위해, 효소 분석의 사용은 이전에보고 된 바있다. (1)이 방법을 산출하는 반응 혼합물과 절개 된 조직의 동결 절편과 배양의 준비가 필요 세포가 기능적 글루코오스 -6- 인산 탈수소 효소 (G6PD) 효소를 생산하는 경우 청색. 그렇지 않은 경우, 셀은 하얗게. 우리는 폴리 비닐 알코올 대신에, 최적의 절단 온도 화합물 OCT () 매체를 이용하여 반응 혼합물을 수정했다. 이는 pH 측정을 용이 G6PD 염색 성분 가용화를 증가시키고 G6PD 효소의 확산을 제한한다. 돌연변이가 줄기 세포에서 발생 함을 입증하기에, 전체 토굴은 G6PD 효소가 부족합니다활동. 줄기 세포 비호에만 G6PD 표현형 돌연변이 토굴에서 자손 모두 G6PD 효소 활성이 결여된다. 줄기 세포의 변이를 식별하는 지하실, 연속 4 인접 동결 절편 (레벨) 7 μm의 두께로 절단 하였다. 인접 컷의 제조 방법은이 같은 변이 토굴 인접한 부분에서 관찰되기 때문에 토굴 완전히 돌연변이 된 형태를 제공한다. 50 ㎛의 간격이었다 조직 샘플과 슬라이드는 마우스 당> 10 4 지하실의 합계를 평가 제조 하였다. 돌연변이 빈도는 치료 그룹의 야생형 (청색) 소낭의 숫자로 ÷ 관측 돌연변이 (흰색) 소낭의 수이다.
Introduction
대장 암은 DNA를 손상시킬 수 환경 에이전트 및식이 구성 요소에 대한 노출을 포함하고 (예를 들어 APC)를 종양 억제 유전자에 돌연변이를 암 유전자에 체세포 돌연변이를 활성화 (예를 들어, 베타 카테닌) 또는 비활성화 생산하는 것으로 생각됩니다. 그러나, 이들 임계 돌연변이 결장 줄기 세포에서 발생하는 것으로 가정한다. 인해 대장 상피의 고유 토굴 아키텍처, 이는 대장 암 발생과 관련된 화학 물질에 동물을 노출 한 후 결장 줄기 세포 돌연변이를 측정 할 수있다. 돌연변이가 토굴 내의 모든 세포에 존재하므로 여러 X-연결 효소는, 줄기 세포에서 발생하는 돌연변이에 대한 지표 역할을 할 수 있습니다.
이전에, 절차는 마우스에서 결장 종양을 유도 화학 또한 X 결합 글루코오스 -6- 인산 탈수소 효소 (G6PD) 유전자 돌연변이 분석을 통하여 대장 체세포 줄기 세포 돌연변이를 생성하는 것이 입증 된 문서. 1-3방법은 임의의 선택 압력없이 결장 줄기 세포 무작위 체세포 돌연변이의 빈도를 정량화. 절차는 처리 및 제어 생쥐로부터 결장 냉동 미 정착 부의 생산 G6PD 기능적 활성을 생산 세포의 결여 소낭의 식별을 포함한다. , 흰색으로 보이는 이러한 돌연변이 지하실은 돌연변이는 돌연변이 G6PD 유전자를 품고 자손 초래했다 줄기 세포에서 발생했음을 나타냅니다. 효소 분석에서, G6PD 결핍 돌연변이 소낭은 니트로 블루 테트라 졸륨 (NBT)의 환원에 필요한 글루코오스 -6- 인산을 산화 할 수 없다. G6PD 효소가 작동하는 경우, 염색 액에 NBT는 효소 및 청색 "염색"셀의 위치에서 축적 불용성 포르 마잔과 침전물로 감소된다. G6PD 돌연변이있는 세포는 푸른 스테인드 야생형 지하실에 대비 희끄무레 남아있다. 이 방법은 "NULL"표현형이 돌연변이를 측정한다. EN 때문에하는 효소, 예컨대 G6PD 같이 섹션이 수용액에 배치되는 경우 비 고정 조직 절편에 세포 밖으로 확산 될 수있는, 그것은 분석 될 수있는 조직 절편에서 효소를 안정화 할 필요가있다. (4)에서의 효소의 안정성 조직은 G6PD 효소 반응에 필요한 시약 작은 분자의 확산을 방해하지 않아야합니다.
우리는 원래의 절차에 큰 변화의 숫자를 만들었습니다. 중요한 효소 염색 배지 pH 조절 및 상기 분석에 사용 된 성분의 용해를 용이하게 최적의 절단 온도 화합물 OCT (), 폴리 비닐 알코올로부터 변경되었다. 각 조직 섹션 G6PD 반응 혼합물을 동일한 용적을 수신하도록 강철 와셔 이루어지는 0.5 ml를 웰 – 염색 0.4을 사용하여 수행된다. 절차없이 결장 조직의 큰 표본을 제공 묘화 부에 소낭의 수를 추정하기 위해 개발 된수동> 각 대장 10 (5) 지하실을 계산합니다. 7 μm의 인접 조직 절편의 분석은 잠재적 염색 아티팩트를 감소 하나 이상의 슬라이드에 토굴 돌연변이의 시각화를 제공한다. 이러한 변경 절차가보다 효율적이고 재현합니다.
이 수정 된 프로토콜을 사용하여, 우리는 설치류 공지 결장 발암 아족시 메탄을 위해 C57BL / 6 마우스의 결장 노출 후 줄기 세포의 돌연변이 빈도를 정량화 하였다. 5-7
Protocol
Representative Results
Discussion
종종 유전자 독성 화합물의 효과는 DNA를 수정하는 능력에 의해 결정된다. 이 작업은 일반적으로 조직을 분리하고 DNA 부가 물의 글로벌 레벨을 측정하여 수행됩니다. AOM, 이것은 결장 O 6 -methylguanine 부가 정량 포함한다. 이러한 줄기 세포의 틈새와 같은 특정 유형의 세포 내에서의 손상에 대한 이러한 접근 정보를 이용하여, 손실된다. 부가 물 중 일부분 결국 고정 돌연변이로 변환되기 때?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 어떤 승인이 없습니다.
Materials
| reagents | |||
| nitroblue tetrazolium | |||
| NADP | |||
| glucose-6-phosphate | |||
| 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate | |||
| dimethyl formamide | |||
| phosphate buffer (pH 7.4 | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | |||
| Equipment | |||
| light microscope equipped with 5 megapixel camera | |||
| cryostat | |||
| warm room |
References
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