Kolon Kök Hücre Mutasyonların Kantitasyonu
Summary
We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.
Abstract
Kök hücre mutasyonları ölçmek için yeteneği, kimyasal potansiyel kansere yol mutasyonlar neden olabilir eğer ve ne ölçüde eleştirel bir hücre popülasyonu ölçmek için güçlü bir araçtır. X-bağlantılı glikoz-6-fosfat dehidrojenaz geni kök hücre mutasyonlan ölçmek için bir enzim testi kullanımı daha önce bildirilmiştir. 1 Bu yöntem, bir veren bir reaksiyon karışımı ile kesitli doku dondurulmuş bölümleri ve inkübasyon hazırlık gerektirir Hücreler fonksiyonel glikoz-6-fosfat dehidrogenaz (G6PD) enzim üreten eğer mavi renk. Eğer değilse, hücreler beyaz görünür. Bu polivinil alkol yerine optimal kesme sıcaklık Bileşik (Ekim) ortamı kullanılarak reaksiyon karışımı olarak var. Bu pH ölçme kolaylaştırır G6PD boyama bileşenlerin çözünürlüğünü arttırır ve G6PD enzimin yayılmasını engellemektedir. Bir mutasyonun kök hücre meydana geldiğini göstermek için, tüm kript G6PD enzimatik yoksun olmalıdırfaaliyet. Bir kök hücre barındıran Sadece eğer bir fenotipik G6PD mutasyon crypt döl tüm G6PD enzimatik aktivitesini yoksun olacak. Kök hücre mutasyonu olan crypts belirlemek için, arka arkaya dört bitişik dondurulmuş kesitler (seviye) 7 um kalınlığında kesildi. Bitişik kesim yapma Bu yaklaşım, aynı mutasyona uğramış crypt bitişik bölümlerde görüleceği beri crypt tam mutasyona edildi uymasını sağlar. 50'den fazla um ayrı olan doku örnekleri ile slaytlar fare başına> 10 4 crypts toplam değerlendirmek için hazırlanmıştır. Mutasyon sıklığı tedavi grubunda yabani tip (mavi) kript sayısına göre ÷ gözlemlenen mutasyona uğramış (beyaz) kript sayısıdır.
Introduction
Kolon kanseri DNA zarar verebilir çevresel ajanlar ve diyet bileşenlerin etkilenmemesi içerir ve (örneğin, APC), tümör baskılayıcı genler mutasyonları onkojenler somatik mutasyonlar aktive (örneğin, ß-katenin) ya da inaktive üretmek düşünülmektedir. Bu kritik mutasyonlar kolon kök hücrelerinde meydana geldiği kabul edilir. Çünkü kolon epitel eşsiz kript mimarisi, bu kolon kanserinin ilişkili kimyasallara maruz hayvanların sonra kolonda kök hücre mutasyonları ölçmek mümkündür. Mutasyonlar, bir kript içinde tüm hücrelerde mevcut olacak şekilde çeşitli X-bağlantılı enzimler, kök hücrelerin meydana mutasyon için gösterge olarak görev yapabilir.
Daha önce, bir prosedür farelerde kalın bağırsak tümörlerini neden kimyasallar da X-bağlı glukoz-6-fosfat dehidrojenaz (G6PD) geni mutasyonlarının analizi ile kolon somatik kök hücre mutasyonlan oluşturulan gösteren basıldı. 1-3Yöntem herhangi bir seçim baskısı olmadan kolon kök hücrelerin rastgele somatik mutasyon sıklığı quantifies. Prosedür muamele edilmiş olan ve kontrol farelerinin sabitlenmemiş dondurulmuş kolon bölümlerinin üretimi ve işlevsel G6PD aktiviteye hücrelerinden yoksun kript tanımlanmasını içerir. , Beyaz görünmesini bu mutasyona uğramış kriptler, mutasyon da mutasyona uğramış G6PD geni barındıran soyu doğurdu kök hücre meydana geldiğini göstermektedir. Enzimatik tahlilde, G6PD eksikli mutant kript nitro mavi tetrazolium (NBT) azalması için gerekli olan glikoz-6-fosfat, okside edilemez. G6PD enzimi işlevsel olduğu zaman, boyama karışımında NBT enzim ve mavi "boyama" hücre yerde biriken çözünmeyen formazana ve çökeltileri düşürülür. G6PD mutantlar hücreler mavi lekeli vahşi tip crypts aksine beyazımsı kalır. Bu yöntem, bir "boş" fenotipe sahip mutasyonları ölçer. Tr Çünküenzimler, örneğin G6PD gibi bölümler, sulu bir çözeltiye yerleştirilmiş ise, bir tespit edilmemiş dokuda bölümündeki hücrelerin üzerinden difüze olabilir, bu analiz edilecek doku kesitlerinde enzim stabilize etmek için gerekli olan. 4 enzim stabilizasyon Doku G6PD enzimatik reaksiyon için gerekli olan küçük reajan moleküllerinin difüzyon engel olmamalıdır.
Biz orijinal prosedüre önemli bir dizi değişiklik yaptık. Kritik enzimatik boyama ortam pH'ının kontrolüne ve deneyde kullanılan bileşenlerin çözünürlüğünü kolaylaştırır Optimal Kesme Sıcaklık Bileşim (Ekim), polivinil alkolden değiştirilmiştir. Her bir doku kesiti G6PD reaksiyon karışımının, aynı hacimde, böylece çelik pullar imal 0,5 mi kuyu – boyama 0,4 kullanılarak gerçekleştirilir. Bir prosedür kalmadan kolon dokusunun büyük bir örnekleme sağlayan görüntülü bölümünde kriptalarının sayısını tahmin için geliştirilmiştirEl> Her kolon için 10 5 crypts saymak. Bitişik 7 mikron doku kesitlerinde analizi, potansiyel boyama eserler azaltır birden fazla slayt üzerinde bir mutant crypt görselleştirme tanıyor. Bu değişiklikler prosedürü daha verimli ve tekrarlanabilir hale.
Bu yeniden protokolü kullanarak, kemirgenlerde iyi bilinen kolon kanserojen azoksimetan C57BL / 6 farelerinin maruz kaldıktan sonra kolon kök hücrelerinde mutasyon sıklığı sayısal var. 5-7
Protocol
Representative Results
Discussion
Genellikle bir bileşimin genotoksik etki DNA değiştirme kabiliyeti tarafından belirlenir. Bu, normal olarak doku izole DNA adduct küresel seviyesinin ölçülmesiyle yapılır. AOM için bu kolonda Ø 6 -methylguanine aduktlar miktarının içerecektir. Böyle kök hücre niş gibi özel hücre tipleri, içinde hasar bu yaklaşım bilgileri kullanarak, kaybolur. Adüktlerinin sadece küçük bir alt grubu sonunda sabit mutasyonlara dönüştürülür Ek olarak, bir DNA adükt mutasyon ile aynı değildir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar herhangi bir onayları vardır.
Materials
| reagents | |||
| nitroblue tetrazolium | |||
| NADP | |||
| glucose-6-phosphate | |||
| 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate | |||
| dimethyl formamide | |||
| phosphate buffer (pH 7.4 | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | |||
| Equipment | |||
| light microscope equipped with 5 megapixel camera | |||
| cryostat | |||
| warm room |
References
- Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry. Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).
- Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. The clonal origin of experimental large bowel tumours. Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).
- Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity. Mutat. Res. 379 (1), (1997).
- Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer’s guide. Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).
- Giardina Rosenberg, D. W., C, T., Tanaka, Mouse models for the study of colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).
- Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate. Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).
- Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane. Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).
- Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells. J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).
- Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). J Vis Exp. (35), (2010).
- Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, . Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice. J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).
- Whetstone, R. D., Gold, B. T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon. Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).
- Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase. Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).
- Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).
- Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation. J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).
