Utilisation de mitochondries isolées à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour microplaques à haut débit respiratoire mesurée

Figure 1 représente les taux de consommation d'oxygène (OCR) pour la pyruvate / malate, succinate / roténone, palmitoyl carnitine / malate, et du glutamate / malate dosages (couplage dosages). Ces tracés d'analyse sont affichés sous forme de consommation d'oxygène Rate, ou OCR, en fonction du temps, sont correceted fond, et sont affichés sous forme de taux de point à point. Chaque panneau représente la consommation d'oxygène dans les différents Etats mitochondriales telles que décrites par Chance et Williams 14. Le premier panneau représente la consommation de base d'oxygène, ou de l'État 2. Le deuxième panel, après l'injection de l'ADP, représente maximale couplée respiration, ou de l'État 3. Le troisième panel, après l'injection de oligomycine A (un inhibiteur du complexe V), représente la respiration due de fuite de protons, ou de l'État 4o. Le quatrième panneau, après l'injection de FCCP, représente maximale respiration découplé ou 3U de l'Etat. Enfin, le cinquième panneau, après injection de antimycine A, représente l'inhibition de la respiration oxydative. Notamment, all états mitochondriales ont écart minime. Cela est dû à un mélange complet du stock mitochondrial et les mélanges mitochondries / substrat, et la réalisation d'une monocouche de mitochondries après le spin de l'adhésion (étape 2.6). D'autre part, le chargement mitochondries inégales dans chaque puits et ne pas atteindre une monocouche des mitochondries dans le puits de la microplaque entraîne une augmentation de l'écart-type dans chaque Etat comme affiché dans la figure 2. Les tracés de la figure 1 affichage plateaux pour chaque état ​​mitochondrial et pour chaque substrat. Le plateau atteint après deux cycles de mesure indique une bonne qualité mitochondrial et que les mitochondries restent collées à la même pendant toute la durée de l'essai. En outre, la réalisation des taux maximum plafonné peut être plus souhaitable car cela permet au chercheur de prendre l'OCR moyenne à ces états mitochondriales, réduisant ainsi biais qui peuvent se produireen sélectionnant arbitrairement un point. La quantité de mitochondries par puits a été déterminée par des essais d'optimisation. La quantité optimale de mitochondries par puits devrait se traduire par État 2 taux entre 100-200 pmol / min / puits et l'état 3 taux <1,500 pmol / min / puits, puisque ces valeurs sont dans la gamme de détection d'oxygène dynamique de l'oxygène multi-puits machine de mesure de la consommation. Chargement trop de protéine mitochondriale par puits peut entraîner des OCR au-delà de la plage dynamique de l'instrument (figure 3A). La figure 3 illustre le chargement de 3,5 ug de protéine mitochondriale par puits (de traçage bleu) par rapport à une charge de 2,5 ug de protéine mitochondriale par puits (rouge le traçage) pour le dosage succinate / roténone. Chargement trop de protéine mitochondriale par puits peut aussi conduire à l'épuisement de l'oxygène dans le microchambre du puits, empêchant ainsi une mesure précise de l'OCR pour chaque mesure successive 9 (figure 3B </strong>). Le point-à-point OCR est le taux de variation instantané de la reconnaissance optique de caractères. Si plat, l'OCR est stable / stable, mais si la baisse, alors il peut être un problème biologique ou technique. La forte baisse des OCR dans l'État de 3 et de l'État 3U respiration (figure 3A) est causée par les mitochondries épuiser les réserves d'oxygène avant la fin de la mesure (figure 3B). La figure 4 représente en fonction du temps OCR pour le dosage de flux d'électrons. Le tracé est corrigée et affichée comme décrit pour la figure 1. Le premier panneau dans cet essai représente État 3U respiration sur pyruvate / malate via complexe I. Le deuxième panel, après l'injection de la roténone, représente l'inhibition du complexe I respiration médiation. Le troisième panel, après l'injection de succinate, représente substrat stimulé 3U de l'Etat avec des électrons entrant dans le ETC au Complexe II (complexe II de la respiration médiation). Le quatrième panneau, après l'injection de Antimycin A, représente l'inhibition de la respiration complexe III et donc totale. Enfin, le cinquième panneau, après l'injection de l'ascorbate / TMPD, représente Complexe IV respiration médiation. Comme pour les tracés de la figure 1, tous les États ont mitochondriales écart minime, et chaque taux a ou presque a atteint un plateau. Figure 1. Accouplement dosages. (A) mM de pyruvate 10 / mM malate 5, (B) succinate 10 mM / 2 uM roténone, (C) 40 uM de palmitoyl carnitine / 1 mM malate, et (D) 10 mM de glutamate / 10 mM malate couplé mitochondriales tracés d'analyse de la respiration, comme déterminé par mesure de la consommation d'oxygène à puits multiples. Les valeurs sont exprimées sous forme de moyenne ± SD. Protéine mitochondriale chargé par puits était de 3,5 ng pour tous les essais, sauf succinate / roténone, qui utilise 2,5 pg de protéine mitochondriale par puits. Les données représentent n = 3 répétitions biologiques appariés. OCR = Taux de consommation d'oxygène; ADP = adénosine diphosphate; Oligo = oligomycine A; FCCP = carbonyle cyanure 4 – (trifluorométhoxy) phénylhydrazone; Anti-A = antimycine A; PYR = pyruvate; SUCC = succinate; ROT = roténone; PAL-C = palmitoyl carnitine; GLUT = glutamate. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2. très variable pyruvate / Malate Assay. 10 mM pyruvate / 5 mM dosage malate Très variable causée par le mélange incomplètement mitochondries du stock mitochondrial dans le substrat / MAS mélange, conduisant ainsi à pro mitochondrial variablesprotéine chargement dans chaque puits. Protéine mitochondriale chargé par puits était de 3,5 pg. Les données représentent n = 3 répétitions biologiques appariés. OCR = Taux de consommation d'oxygène; ADP = adénosine diphosphate; Oligo = oligomycine A; FCCP = carbonyle cyanure 4 – (trifluorométhoxy) phénylhydrazone; Anti-A = antimycine A; PYR = pyruvate. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3. La surcharge mitochondriale protéines pour le succinate / roténone Assay. (A) les taux de consommation d'oxygène en dehors de la plage dynamique de la machine de mesure de la consommation d'oxygène multi-puits causé par le chargement de 3,5 ug de protéine mitochondriale par puits (de traçage bleu) par rapport à une charge de 2,5 ug de protéine mitochondriale par puits (de traçage rouge). (B ) OxyGen tension proche de zéro et des injections suivantes ADP FCCP provoqué par un chargement excessif protéine mitochondriale (3,5 ug) par puits (tracé bleu), comparativement à charger une quantité optimale (2,5 ug) de la protéine mitochondriale par puits (de traçage rouge). Les données représentent n = 3 répétitions biologiques appariés par quantité de protéine mitochondriale. OCR = Taux de consommation d'oxygène; ADP = adénosine diphosphate; Oligo = oligomycine A; FCCP = carbonyle cyanure 4 – (trifluorométhoxy) phénylhydrazone; Anti-A = antimycine A; SUCC = succinate; ROT = roténone; 2 O = oxygène; mm Hg = millimètres de mercure. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4. Essai de débit Electron. 5 mM de pyruvate / 1 mM + malate 4 uM FCCP, électrons ffaible dosage de respiration mitochondriale traçage tel que déterminé par la mesure de la consommation d'oxygène multi-puits. Les valeurs sont exprimées sous forme de moyenne ± SD. Protéine mitochondriale chargé par puits était de 3,5 pg. Les données représentent n = 3 répétitions biologiques appariés. OCR = Taux de consommation d'oxygène; Anti-A = antimycine A; Asc = ascorbate; TMPD = N, N, N ', N' tétraméthyl- p-phénylènediamine. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Réactif Stock Concentration MW Volume final Masse ajoutée Commentaires / Description (M) (g / mole) (ml) </strong> (g ou ml) EGTA, pH 7,2 0,1 380,35 100 ml de 1M Tris base 3.801 g Conserver à 4 ° C HEPES 1 238,3 250 ml de Dih 2 O 59. 57 g Conserver à 4 ° C MgCl 2, hexahydrate 1 203,31 250 ml de Dih 2 O 50,82 g Conserver à 4 ° C Pyruvate pH 7,4 0,1 88.06 (Livré que 14.11 M solution) 40 ml de Dih 2 O 0.283 ml d'acide pyruvique Assurez aliquotes de 1 ml et conserver à -20 ° C, effectuer frais toutes les deux semaines Succinate pH 7,4 0,5 118.09 100 ml de Dih 2 O 9,4 g de sul'acide ccinic Assurez aliquotes de 1 ml et conserver à -20 ° C Malate, pH 7,4 0,5 134.09 100 ml d'éthanol à 95% 6,7 g d'acide malique Assurez aliquotes de 200 pi et conserver à -20 ° C TMPD 0,01 164.25 10 ml 0,0164 g Faire 300 aliquotes et conserver à -20 ° C; Mélanger avec une quantité équimolaire d'ascorbate de garder TMPD réduite Palmitoyl chlorure de L-carnitine 0,01 436,07 1,14 ml d'éthanol à 95% 0,005 g Faire 40 aliquotes et conserver à -20 ° C Un oligomycine 0,006 791,06 0,987 ml d'éthanol à 95% 0,005 g Faire 20 aliquotes et conserver à -20 ° C </tr> FCCP 0,01 254,17 3,9 ml d'éthanol à 95% 0,01 g Faire 40 aliquotes et conserver à -20 ° C Roténone 0,001 394,4 10 ml d'éthanol à 95% 0,0039 g Conserver à -20 ° C Antimycine A 0,005 548,63 9,12 ml d'éthanol à 95% 0,025 g Conserver à -20 ° C K + ADP 0,5 501,32 3,9 ml de Dih 2 O 1,0 g Conserver à -20 ° C L'acide malique, pH 7,4 0,5 134.09 40 ml 2,68 g Assurez aliquotes de 200 pi et conserver à -20 ° C <strong> Tableau 1. Image Solutions Réactif Stock Concentration Masse ajoutée Molarité finale / Pourcentage (M) (g ou ml) Saccharose – 11,98 g 70 mM Mannitol – 20.04 g 220 mm Phosphate de potassium monobasique – 0,34 g 5 mM MgCl 2, hexahydrate 1 2,5 ml 5 mM HEPES 1 1,0 ml 2 mM EGTA 0,1 5,0 ml 1 mM Essentiellement Fatty Acid Free-BSA – 1,0 g 0,20% . Tableau 2. MAS Mix pH 7,4, 500 ml: 25 ml aliquotes et conserver à -20 ºC * Note: Exclure BSA pour MAS mélange utilisé pour les injections de dosage. Substrat moyen Concentration finale Montant de stock (ul) Montant du MAS * (ml) Pyruvate / Malate 10 mM / 5 mM Pyruvate: 1000 9 Malate: 100 Succicinate / roténone 10 mm / 2 pM Succinate: 200 10 Roténone 20 * Pyruvate / Malate + FCCP 5 mM / 1 mM / 4 pM Pyruvate: 500 10 FCCP: 4 Malate: 20 Palmitoyl L-carnitine / Malate 40 uM / 1 mM Palmitoylcarnitine: 40 Malate: 20 10 Glutamate / malate 10 mM / 10 mM Glutamate: 400 10 Malate: 200 Tableau 3. Solutions Substrat pH 7.4: Faire fraîches le jour de l'expérience. * Electron solution d'analyse de flux. Injection moyen Concentration Montant de stock (ul) <td> Montant de la MAS (ml) Montant injecté dans la cartouche Concentration finale (Après injecté dans la plaque) ADP 50 mM 300 ul 3 50 ul 5,0 mm Un oligomycine 20 pM 10 ul 3 55 pi 2,0 pM FCCP 40 pM 12 pi 3 60 ul 4,0 pm Antimycine A 40 pM 24 pi 3 65 pi 4,0 pm T4. capables injections pour les dosages couplés de pH 7,4:. Assurez frais le jour de l'expérience. * Des analyses de couplage comprennent (mais ne sont pas limités à) un pyruvate / malate, le succinate / roténone, palmitoyl carnitine / malate, glutamate et / malate. Injection moyen Concentration Montant de stock (g ou ul) Montant de la MAS (ml) Montant injecté dans la cartouche Concentration finale (après injecté dans la plaque) Roténone 20 pM 60 ul 3 50 ul 2,0 pM Succinate 50 mM 300 ul 3 55 pi 5,0 mm Antimycine A 40 pM 24 μ; l 3 60 ul 4,0 pm TMPD / Ascorabte 1 mM, 100 mM TMPD: 300 ul 3 65 pi 100 uM, 10 mM Ascorbate: 0,059 g Tableau 5. Les injections de flux d'électrons dosage de pH 7,4. Faire frais le jour de l'expérience Commande Temps (min) Nombre de cycles Étalonner Attendez 10 min (pour permettre à la plaque pour réchauffer de l'étape de l'adhésion) Mélanger 1 min 2 MoiAsure 2 min Injecter A Mélanger 1 min 2 Mesure 2 min Injecter B Mélanger 1 min 2 Mesure 2 min Injecter C Mélanger 1 min 2 Mesure 2 min Injecter D Mélanger 1 min 2 Mesure 2 min Tableau 6. Instrument Protocole Exécuter.