높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아 격리 사용
Summary
The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.
Abstract
Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.
Introduction
골격근 미토콘드리아의 주요한 생리적 역할은 산화 적 인산화 (1)로부터 ATP를 생산하는 것이다. 중요한 것은, 골격근 미토콘드리아 3, 4 및 퇴행성 질환 타입 II 당뇨병 5 노화, 운동 능력 2에서 특정 역할을 담당한다. 고령화 사회, 타입 II 당뇨병 미국 6 죽음의 7 번째 주요 원인 인 것으로, 미토콘드리아의 기능을 평가하는 방법에 대한 필요성은 생물 의학 연구 7,8에서 점점 더 유행이되고있다. 이 산화 적 인산화 (9)의 기능적 구성 요소를 표현하는 미토콘드리아 게놈과 핵 사이의 조정 기능을 나타내므로 특히, 산소 소비량의 측정은 미토콘드리아 기능의 평가에 특별한 유틸리티를 갖는다.
몇 가지 기술은 그대로 셀의 산소 소비량의 측정을 가능하게하고 분리 존재D 미토콘드리아 7-10. 또한, 분석은 여러 유형의 세포와 조직을 위해 개발하고 미토콘드리아 호흡 경로 및 제어 9,11,12의 측정을 허용하는 다양한 종에왔다. 그러나, 마이크로 기반의 산소 소비 기술에 사용하기 위해 마우스 골격 근육에서 고립 된 미토콘드리아를 사용하여 이러한 분석의 모든 편집에 관해서 문헌 보이드는 현재이있다. 중요한 것은, 마이크로 기반 호흡계 분석의 사용은 미토콘드리아 생물 학자 가운데 성장과 격리 된 미토콘드리아 9 최소한의 양을 사용하여 높은 처리량 측정을 가능하게한다. 따라서, 마이크로 호흡계 기반 분석법 컬렉션 이상 및 / 또는 적응은 전자 전달계 (ETC)에서 발생 될 수있는 위치의 수 정확히 파악이 개발되었다. 또한, 두 개의 추가 마이크로 기반 호흡계 분석은 조정의 평가 betwee을 사용하는 것이 개발되었다트리 카르 복실 산 (TCA) 사이클 등과 β-산화 및 ETC. 사이의 N 중요하게는, 제시된 방법은 일반적으로 사용되는 동물 모델에서 미토콘드리아 기능에 기계적 변화를 측정 명확하고 간결한 방법을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
마우스 골격근 100 mg의 -이 문서에 제시된 방법은 (75)에서 분리 된 미토콘드리아를 사용하여 마이크로 기반 호흡계 분석의 컬렉션의 성능에 대한 단계별 지침을 제공합니다. 삼중 웰 간의 긴밀한 표준 편차에 의해 증명 이러한 분석은 높은 정밀도로 수행 될 수있다. 중요하게는, 이러한 분석은 호흡계 이상 및 / 또는 적응은 일반적으로 사용되는 동물 모델에서 ETC, TCA 사이클, β 산화 경로, 기판 컨베이어 등에서 발생 될 수 있고, 여기서 정확히 파악 허용한다.
그것은이 프로토콜에 사용되는 각종 연료 및 억제제를 사용하기위한 이론적 근거를 강조하는 것이 중요하다. 피루브산 / 말산 및 글루타메이트 / 말산 호흡계 분석은 단지 I 매개 호흡의 평가뿐만 아니라, 각 컨베이어의 평가를 허용하고, 글루타메이트의 경우, 아미나 15. 다르게는, 조합로테 복잡한 I을 억제하고 숙시 네이트는 아데닌 디 뉴클레오티드 플라 빈의 감소를 통해 복잡한 II에 전자를 제공하기 때문에 숙시 네이트 / 로테 논은 (FADH 2) (15) ETC의 복잡한 II를 통해 미토콘드리아 호흡 플럭스의 평가를 할 수 있습니다. 이러한 분석은 커플 링 효율 및 최대 호흡으로 기판에 특정 정보를 제공한다. 전자 유동 검정은 기질 및 억제제의 조합은 미토콘드리아 호흡 플럭스 9 중 여러 착체의 평가를 허용한다는에서 독특하다. 숙시 네이트 다음 로테의 주입은 단지 II에 의해 구동 평가 최대 호흡을 허용하면서 피루브산 / 말산 + FCCP의 초기 기판 믹스, 단지 내가 의해 구동 최대 호흡의 평가를 할 수 있습니다. 아스 코르 베이트의 주입 하였다 Antimycin의 주사, 복합 III 억제제가 / TMPD는 아스코르브 때문에 복잡한 IV에 의해 구동 호흡의 평가를 허용 / TMPD는이다시토크롬 C / 단지 IV에 전자 공여체. 커플 링 효율에 관한 정보가 얻어지지 않는 동안, 상기 방법은 독립적으로 실행되는 다수의 기판들을 배제 매우 작은 샘플 크기에 적합하다. 마지막으로, 팔미 토일 카르니틴 / 말 레이트의 사용이 β 산화 및 팔 미트 산 (β 산화)의 산화로부터 생성되는 환원 당량 보낸 ETC 사이 코디 평가 허용는 flavoprotein 15 전사 전자 통하여 ETC로 공급. 이는 커플 링 및 전자 흐름 분석은 인해 일부 개입 (약물 치료, 유전자 조작)으로 미토콘드리아 기능의 변화를 식별하기 위해 직렬로 사용될 수 있음을 주목해야한다.
이러한 분석을 위해 얻어 고정밀는 단백질 결정에, 또는 기판 솔루션 이전인지, 미토콘드리아의 완전한 혼합에 주로 기인한다. 이와 더불어, 미토콘드리아 일단 기판 solutio에 resuspendend됩니다NS, 그것은 넓어진 오리피스 피펫 팁으로 단계 2.2에 기재된 바와 같이 세포 배양 플레이트를 로딩하기 전에 철저이 용액을 혼합하는 것이 중요하다. 미토콘드리아를 혼합하지 않으면 철저하게 분석 내에서 큰 변화로 이어질 것입니다. 또한, 미토콘드리아를 혼합하는 동안 전단력을 만들 좁은 오리피스 피펫 팁을 사용하여 부착 단계 (2.7)이이 프로토콜의 중요한 단계 인 미토콘드리아 막 사이토 크롬 C의 방출을 손상시킬 가능성을 증가시킨다. 긴 / 충분히 빨리로드 된 세포 배양 판을 회전하지 않으면, 따라서 우물과 측정 사이 증가 변동성을 선도, 잘에 미토콘드리아의 완전 준수가 발생합니다.
주식과 기판 솔루션을 만들기 위해 올바른 농도 / 준비 방법을 사용하여, 당 잘 미토콘드리아 단백질의 최적 량을로드, 분석 실행을 변경 미토콘드리아 상태 괞 찮아을 보장하기 위해 : 설명 프로토콜을 포함하는 최적화 된teaus하고, 미토콘드리아 주식과 미토콘드리아 / 기판 믹스의 적절한 혼합. 이러한 최적화 노력에 앞서, 저자는 분석 실행에 함정을 발견했습니다. 다음은 문제 해결 방법 /이 프로토콜을 최적화하는데 도움이되었다 수정에 대해 설명합니다. microchamber 내에서 산소를 배출하고 부정확 한 측정으로 이어질 것입니다 너무 많은 미토콘드리아를로드하는 동안 최적의 로딩과 관련하여, 로딩이 너무 작은 미토콘드리아는 강력한 반응을 유도하지 않습니다. 로저스 등 9 마이크로 기반 호흡계 분석 잘 당 미토콘드리아의 최적의 급지 량을 결정하는 예제를 제공합니다. 더 자주, 너무 많은 미토콘드리아는 당로드뿐만 아니라 국가에 의해 입증이 비율을 100 ~ 200 pmol의 / 분 이상 / 웰과 주 3 비율> 1500 pmol의 / 분 / 잘된다. (. – 10 μg의 예 (1) 사이) 내에서 동적 R OCRs을 이끌어내는 위에로드가 발생하는 경우, 미토콘드리아 단백질을 다양한 농도로 실험을 수행산소 소모량 측정 기계의 앤지. 준비 및 기판과 주식의 정확한 농도를 사용하는 것이 가장 중요합니다. 항상 기판 / 주사의 산 형태를 사용하고, 수산화 칼륨 또는 HCl로 pH를 조정; 나트륨 버퍼 / 솔루션은 사용하지 않는 것이 좋습니다. 또한, 재 부유 기판 / DMSO 또는 100 % 에탄올의 주식은 측정 오류 또는 오류가 발생합니다. 명시된 경우 95 % 에탄올을 사용하십시오. 이는 카르니틴 팔미 토일 따라서 큰 변동을 초래 동결 스톡을 해동 후 95 % 에탄올 침전에 대해 일반적이다. 사용하는 것이 아니라 이전 팔미 토일 카르니틴 재고 및 소용돌이를 따뜻하게해야합니다. 또한, 매우 다양 피루 베이트 / 말 산염 분석 결과로 인해 이주 된 피루브산 스톡 존재>로 할 수있다. 피루브산의 냉동 분량 씩 2 주마다 리메이크해야합니다. 분석 실행은 미토콘드리아 상태 고원을 보장하기 위해 2 분 측정에 수정되었습니다. ADP의 고갈의 관찰이 필요한 경우, 연구자는 할 수있다"분석 마법사 '포럼에서"프로토콜 "탭에서 측정 시간을 연장. 마지막으로, 큰 변화는 미토콘드리아 주식과 미토콘드리아 플러스 기판 솔루션은 로딩 전에 완전히 균질화되지 않을 때 발생합니다. 우물 사이의 변동성 분석 실행 한 후 높은 경우, 완전히 전에 다음 실험에 기질 용액을 혼합해야합니다. 절대로 미토콘드리아 / 기판 솔루션을 와동하지 않고, 매쉬를 저어 부드럽게 넓어진 구멍 피펫 팁으로 씹다.
주목할 가치가있는이 기술의 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 먼저, 분석 방법에 사용되는 세포 배양 플레이트에 웰의 개수가 상대적으로 낮다 (예., 24 웰과 블랭크 웰을 위해 지정된 적어도 2). 그것은 하나의 플레이트에 상기 분석의 모든 5를 수행하고자하는 경우, 연구자는 한 번에 하나의 마우스에서의 응답을 검사 할 수있다. 그러나, 96 웰 악기 highe에 사용할 수 있음을 주목해야한다R 처리량. 둘째, 손상 세포 1에 비해 절연 미토콘드리아에서 미토콘드리아 기능 장애를 평가하는 고유의 강점과 약점이있다. 일부 약점은 그대로 세포 분리 과정에서 유도 유물에 비해 적은 생리 학적 관련성을 가지고 있습니다. 마지막으로,이 방법의 성공은 미토콘드리아 분리 프로세스의 품질에 조건부이다.
이러한 분석의 일부는 두 가지 시스템에 개발되어왔다 또는 다른 동물 모델에서 입증되었지만, 본원에 제시된 방법은 멀티 웰 산소 소비량 측정 기계를 사용 마우스에 최적의 상태로 상기 분석 모두를 합성 최초로 골격근. 따라서, 최소한의 재료로 높은 처리량을 제공하는 마우스 골격근 100 mg의 – 중요한 것은, 이러한 모든 분석은 5 ~ 75으로부터 격리 미토콘드리아의 양으로 수행 될 수있다. 큰 의미, 멀티 웰의 능력산소 소비 기술은 최적화 된 분리 방식을 조합 미토콘드리아의 최소 수량과 분석을 수행하는 연구자는 골격근 조직의 나머지와 다른 실험 (예., 웨스턴 블롯의 다수를 수행 할 수 있도록, RT-PCR, 효소 적 분석법, 종종이 동물 모델과 투쟁 등).
결론적으로, 여기에 제시된 방법은 마우스 골격 근육의 최소한의 양을 사용하여 마이크로 기반 호흡계 분석의 컬렉션의 성능에 대한 단계별 지침을 제공합니다. 중요한 것은, 제시된 방법은 조직과 미토콘드리아의 최소한의 양을 필요로한다. 마스터 일단 본 명세서에 기재된 기술은 연구자들이 흔히 사용되는 동물 모델에서 미토콘드리아의 산소 소비량의 화합물 또는 유전자 생성물의 전위기구를 결정하는 것을 허용 할 것이다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.
Materials
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | Store at room temperature |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | Store at room temperature |
| Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0% | Sigma Aldrich | P5379 | Store at room temperature |
| Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0% | Sigma Aldrich | M9272 | Store at room temperature |
| HEPES minimum 99.5% titration | Sigma Aldrich | H3375 | Store at room temperature |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | Store at room temperature |
| Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | Store at 4°C |
| Acid Free- BSA | |||
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4°C |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature |
| L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | Store at room temperature |
| 99%, powder [TMPD] | |||
| Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20°C |
| Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20°C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8°C |
| phenylhydrazone | |||
| ≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
| Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20°C |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20°C |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
References
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