Целые сетчатки Экспланты из куриных эмбрионах для обработок Электропорация и химического реагента

Сетчатка является частью центральной нервной системы, и это, с его относительной простотой и хорошо характеризуется сотовой архитектуры, популярной модели для изучения развития центральной нервной системы. Глаз эмбриона курицы является относительно большим по сравнению с остальной частью эмбриона. Поэтому легко доступны в яйце для экспериментальных манипуляций, таких как инъекции или электропорации, и служит отличным инструментом для получения знаний о клетке сетчатки и биологии развития в естественных условиях. Несмотря на эти основные преимущества, выживание эмбрионов может быть низким, когда эксперименты являются инвазивными, такие как с electroporations, повторных инъекций, или в сочетании экспериментальных манипуляций.

Электропорация плазмид ДНК в курином эмбрионе в яйце является важным и хорошо создана методика ^1. Это позволяет для маркировки нейронов, отслеживание судьбы клеток, а также нервных путей в центральной NERVПодразделения системы, и это позволяет внематочной экспрессии генов для анализа функции белка в естественных условиях. Методика была использована для изучения нервной трубки ^{2, 3} заднего мозга, и сетчатки ^4. Электропорация эмбрионального сетчатки в яйце есть некоторые экспериментальные трудности, связанные с в естественных условиях ситуации. Положение глаз, из-за черепно-мозговой складывания эмбриона, находится относительно близко к сердцу. Эта близость повышает риск сердечного приступа следующий электропорации, и риск увеличивается с возрастом эмбрионов. Кроме того, для доступа к глаз, необходимо открыть эмбриональных мембран, тем самым увеличивая риск кровотечения, пороков развития и последующего снижения жизнеспособности. При тестировании и оптимизации новой плазмиды ДНК часто без известной фенотипической исхода, эти ограничения могут снизить эффективность и силу метода даже для опытного экспериментатора. Как представлено в настоящем протоколе, культуры шдыры сетчатки эксплантов, определяется как весь нервной сетчатки с пигментным эпителием удаляется, является эффективным методом, который дополняет в ово подхода.

Интраокулярные инъекции химических реагентов относительно легко выполнить в яйце. Тем не менее, эффективное и точное содержание вводимых реагентов в нейронном сетчатки может быть трудно полностью контролировать. Вводимый объем может изменяться из-за утечки и точное место инъекции может повлиять как на распределение реагента в глаза и распространение через стекловидное тело. Изменчивость будет иметь серьезные последствия для интерпретации результатов при т.е. кривая доза-ответ для ингибитора фермента определяется; в частности, если эффект мал и временного окна эффекта является узким. Кроме того, только один глаз может быть использовано от каждого эмбриона при выполнении экспериментов в ово-за возможных системных эффектов через кровьна противоположной глаза. Возраст соответствия важно при изучении развития и индивидуальную изменчивость между лечение и контрольных эмбрионов может привести к дополнительной экспериментальной изменчивости.

По этим причинам, экс ово методом, основанным на эксплантатов сетчатки от куриных эмбрионах был разработан, в которой нейронные сетчатки могут быть подвержены равномерной и контролируемых экспериментальных условий в пробирке. Настоящий Протокол был разработан на основе предыдущих протоколов ^5-9. Эксплантатов сетчатки от стадии (й) 20 (эмбриональные дней [E] 3) ST31 (Е7) куриных эмбрионов иссекали, культивируют и электропорации с определенной концентрации плазмидной ДНК или подвергается среде, содержащей определенное концентрации химического реагента. Протокол, представленные здесь была успешно реализована в последних публикациях, используя несколько различных химических реагентов, в том числе регуляторов повреждения ДНК пути, такие, как KU55933, SB 218078 и 109555 Дито НСКsylate и клеточный цикл, таких как Cdk1 / 2 ингибитора III ^10,11.