Explants רשתית שלם מעוף עוברים לטיפולי Electroporation וכימיים מגיב
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לנתח, ניסוי לתפעל וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. תרבויות explant הן שימושיות כאשר שיעור הצלחה גבוהה, יעילות ושחזור יש צורך לבדוק את ההשפעות של פלסמידים לelectroporation ו / או חומרים מגיב, כלומר, מעכבים האנזימטית.
Abstract
הרשתית היא מודל טוב למערכת העצבים המרכזית בפיתוח. הגודל הגדול של העין והכי חשוב הנגישות למניפולציות ניסוייות באובו / in vivo הופך את הרשתית העוברית עוף מודל ניסיוני רב-תכליתי ויעיל מאוד. למרות רשתית העוף קלה למקד באוב על ידי זריקות או electroporation התוך עיני, הריכוז היעיל ומדויק של חומרים כימיים בתוך הרשתית עלול להיות קשה לשליטה מלאה. זה יכול להיות בגלל וריאציות של האתר המדויק הזרקה, דליפה מהעין או דיפוזיה אחידה של החומרים. יתר על כן, בתדירות של מומים ותמותה לאחר מניפולציות פולשנית כגון electroporation היא גבוהה למדי.
פרוטוקול זה מתאר לשעבר אובו הטכניקה לculturing explants רשתית שלם מעוברי עוף ומספק שיטה לחשיפה מבוקרת של הרשתית לחומרים כימיים. פרוטוcol מתאר כיצד לנתח, ניסוי לתפעל, וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. Explants יכול להיות מתורבת לכ 24 שעות ויהיה נתון למניפולציות שונות כגון electroporation. היתרונות העיקריים הם כי הניסוי אינו תלוי בהישרדות של העובר וכי הריכוז של המגיב הציג יכול להיות מגוון ומבוקר על מנת לקבוע ולייעל את הריכוז האפקטיבי. יתר על כן, הטכניקה היא מהירה, זולה ויחד עם השיעור הגבוה הניסיוני שלה להצלחה, הוא מבטיח לשחזור תוצאות. יודגש כי היא משמשת כמצוינת כדי להשלים את הניסויים שבוצעו באוב.
Introduction
הרשתית היא חלק ממערכת העצבים המרכזית ואת זה הוא, בפשטותה היחסית ואדריכלות סלולרית מאופיינת היטב, דגם פופולרי לחקר התפתחות מערכת עצבים מרכזית. עינו של עובר העוף היא יחסית גדולות בהשוואה לשאר העובר. לכן נגיש בקלות באובו למניפולציות ניסיוניות, כגון זריקות או electroporation, ומשמש ככלי מצוין לצבור ידע על תאים ברשתית וביולוגיה התפתחותית בvivo. למרות יתרונות הגדולים אלה, הישרדות של העוברים יכולה להיות נמוכה כאשר ניסויים פולשניים כגון עם electroporations, זריקות חוזרות ונשנות, או מניפולציות ניסיוניות משולבות.
Electroporation של פלסמידים DNA לעובר העוף באובו הוא טכניקה חשובה ומבוססת 1. היא מאפשרת תיוג של תאי עצב, התחקות של גורל תא, כמו גם שטחים עצביים בnerv המרכזימערכת היחידות הארגוניות והיא מאפשרת לביטוי גנים מחוץ לרחם לנתח תפקוד חלבון in vivo. הטכניקה נוצלה בעבר ללימודים של צינור עצבי 2, המוח האחורי 3, ורשתית 4. יש Electroporation של רשתית עוברית באוב כמה קשיים ניסיוניים הקשורים למצב in vivo. העמדה של העין, בשל קיפול הגולגולת של העובר, קרובה יחסית ללב. קרבה זו מגדילה את הסיכון של דום לב לאחר electroporation, והסיכון עולה עם גיל העובר. יתר על כן, כדי לגשת לעין, יש צורך לפתוח את הקרומים העובריים, ובכך להגדיל את הסיכון לדימום, מומים וכדאיות מופחתים שלאחר מכן. כאשר בודקים ואופטימיזציה פלסמיד דנ"א חדש לעתים קרובות ללא תוצאה פנוטיפי ידועה, מגבלות אלה עשויות להקטין את היעילות וכוחה של השיטה אפילו בניסויים מנוסים. כפי שהוצג בפרוטוקול זה, התרבות של wexplant החור ברשתית, שהוגדר כרשתית עצבית השלמה עם אפיתל הפיגמנט הוסר, הוא שיטה יעילה המשלימה בגישת אוב.
זריקות תוך עיניות של ריאגנטים כימיים קלות יחסית לביצוע באוב. עם זאת, הריכוז היעיל ומדויק של חומרים כימיים שהוחדרו בתוך הרשתית העצבית עלול להיות קשה לשלוט באופן מלא. הנפח המוזרק עשוי להשתנות עקב דליפה ואתר הזרקה המדויק עשוי להשפיע הן על חלוקת מגיב בתוך העין ודיפוזיה דרך הגוף הזגוגי. ההשתנות תהיה השלכות משמעותיות על הפרשנות של התוצאות כאשר כלומר, עקומת תגובה למינון מעכב אנזים נקבעה; במיוחד אם ההשפעה היא קטנה והחלון הזמני של ההשפעה הוא צר. יתר על כן, רק עין אחת יכולה לשמש מכל עובר בעת ביצוע ניסויים באובו בשל השפעות מערכתיות פוטנציאליות דרך זרם הדםעל העין הנגדית. התאמת גיל היא חשובה כאשר לומדים פיתוח והשתנות בודדות בין מטופלים ועוברים בקרה עשויה להוביל לשונות ניסיוניות נוספות.
מסיבות אלה, לשעבר אוב שיטה המבוססת על explants רשתית מעוברי עוף פותח, שברשתית העצבית יכולה להיות חשופה למדים ובשליטת תנאי ניסוי במבחנה. הפרוטוקול הנוכחי פותח על בסיס פרוטוקולים קודמים 5-9. explants רשתית מבמה (רח ') 20 (ימים עובריים [E] 3) לst31 (E7) עוברי עופות נותחו, תרבותי וelectroporated עם ריכוז פלסמיד דנ"א מוגדר או שנחשפו למדיום המכיל ריכוז מוגדר של מגיב כימי. הפרוטוקול המובא כאן כבר מיושם בהצלחה בפרסומים האחרונים, באמצעות כמה ריאגנטים כימיים שונים, כולל רגולטורים של מסלול הנזק לדנ"א, כגון KU55933, SB 218,078, ומועצה לביטחון לאומי 109,555 דיטוsylate, ומחזור התא, כגון Cdk1 / 2 מעכב שלישי 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעבודה זו בפרוטוקול מפורט לנתיחה, electroporation או טיפול כימי, וculturing של explants רשתית השלם מעוברי עוף מוצג. פרוטוקול זה הוא קל, מהיר ומאפשר לשניהם שיעור הצלחה גבוה ושחזור תוצאות.
Electroporation של explants רשתית השלם מייצר שטחים גדולים של…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond and St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.
Materials
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10xDPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 734-0006 | |
| 100 μL pipette tips | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 mL disposable plastic cuvette | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-well plate | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 391-1998 | |
| 70% ethanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300nM in 0.01% DMSO |
| Cell culture incubator | Thermo Forma | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodes | Platina, custom made | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Nutrient mix | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Freezing medium NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP expressing DNA plasmid (pZGs) | |||
| Humidified incubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| Mounting medium ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Paraffin film | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way embedding mold | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillin streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| PhosphoHistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Dilution 1/4000 |
| Platinum electrodes (custom made from "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Dia: 4mm, 0.1 mm thickness |
| Platimun electrodes | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Polyethylene pasteur pipette | VWR | 612-2853 | |
| Rotator shaker | VWR | 444-2900 | |
| Small spoon | VWR | 231-2151 | |
| Sucrose | VWR | 443815S | |
| White Leghorn eggs | Local supplier | ||
| Wine cooler | WineMaster 24, Caso, Berlin Germany |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Method. 24, 43-48 (2001).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain. J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. J Vis Exp. , (2012).
- Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina. Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).
- Tomita, K., et al. Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis. Neuro. 16, 723-734 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).
- Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors. Exp eye re. 93, 556-564 (2011).
- Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway. Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).
- Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest. Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).
- Sauer, F. Mitosis in the neural tube. J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).
