Hele netvlies Explantaten van kippenembryo's voor Elektroporatie en chemische reagens Behandelingen

Het netvlies is onderdeel van het centrale zenuwstelsel en is met zijn relatieve eenvoud en goed gekarakteriseerde cellulaire architectuur, een populair model voor de studie van ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel. Het oog van het kippenembryo relatief groot in vergelijking met de rest van het embryo. Het is dus gemakkelijk toegankelijk in ovo voor experimentele manipulaties, zoals injecties of elektroporatie, en vormt een uitstekend hulpmiddel om kennis retinale cel en ontwikkelingsbiologie in vivo te verkrijgen. Ondanks deze grote voordelen kan overleving van de embryo's laag zijn wanneer experimenten invasieve zoals bij electroporations, herhaalde injecties of gecombineerde experimentele manipulaties.

Elektroporatie van DNA plasmiden in het kippenembryo in ovo is een belangrijke en gevestigde techniek ^1. Het maakt het kenmerken van neuronen, het traceren van lot van de cel en neuronale stukken in het centrale Nervous systeem en maakt ectopische genexpressie te analyseren eiwitfunctie in vivo. De techniek is gebruikt voor studies van neurale buis ^2, achterhersenen ³ en ⁴ retina. Elektroporatie van de embryonale retina in ovo heeft enkele experimentele problemen die verband houden met de in vivo situatie. De positie van het oog, vanwege het craniale vouwen van het embryo, relatief dicht bij het hart. Deze nabijheid verhoogt het risico van een hartstilstand elektroporatie, en het risico neemt toe met de leeftijd van het embryo. Bovendien, om het oog, is het noodzakelijk om de embryonale membranen openen, waardoor het risico van bloeden, misvormingen en daaropvolgende verminderde levensvatbaarheid verhogen. Bij het testen en optimaliseren van een nieuwe DNA-plasmide vaak zonder een bekende fenotypische resultaat, kunnen deze beperkingen de effectiviteit en kracht van de werkwijze, zelfs voor een ervaren experimentator verminderen. Zoals gepresenteerd in dit protocol, de cultuur van de whole retinale explantatie, gedefinieerd als het geheel neurale retina met pigment epitheel verwijderd, is een efficiënte methode die een aanvulling op de in ovo benadering.

Intraoculaire injecties van chemische reagentia relatief gemakkelijk uit te voeren in ovo. Toch kan de doeltreffende en nauwkeurige concentratie ingespoten reagentia in de neurale retina moeilijk volledig te controleren. De geïnjecteerde volume kan variëren als gevolg van lekkage en de exacte plaats van injectie kan zowel de verdeling van de reagens binnen het oog en de diffusie door het glasachtig lichaam beïnvloeden. De variabiliteit heeft grote gevolgen voor de interpretatie van de resultaten bij dwz een dosis respons curve voor een enzymremmer bepaald hebben; vooral als het effect klein en de vensterfuncties van het effect is smal. Bovendien kan slechts één oog worden uit elk embryo bij het ​​uitvoeren van in ovo experimenten vanwege mogelijke systemische effecten via de bloedstroomop het contralaterale oog. Leeftijd matching is belangrijk bij het bestuderen van de ontwikkeling en de individuele variatie tussen behandelde en controle embryo's kan leiden tot extra experimentele variabiliteit.

Daarom ex ovo methode gebaseerd op retinale explantaten van kippenembryo's ontwikkeld, waarbij de neurale retina kan worden blootgesteld aan een uniform en gecontroleerde experimentele conditie in vitro. Het huidige protocol is ontwikkeld op basis van eerdere protocollen ^5-9. Retinale explantaten uit stap (e) 20 (embryonale dagen [E] 3) naar ST31 (E7) kippenembryo's werden ontleed, gekweekt en geëlektroporeerd met een gedefinieerde DNA plasmideconcentratie of blootgesteld aan een medium met een bepaalde concentratie van een chemisch reagens. De hier gepresenteerde protocol is met succes geïmplementeerd in recente publicaties, met behulp van verschillende chemische stoffen, met inbegrip van toezichthouders van de DNA-schade route, zoals KU55933, SB 218.078 en NSC 109.555 ditosylate en de celcyclus, zoals Cdk1 / 2 inhibitor III ^10,11.