Desentrañar Aceleración Entropic Tasa inducida por solventes Dinámica de Membrana Enzimas

Modelado 1. En Silico ordenador Descargar una estructura de AP de la proteína de interés del banco de datos de proteínas (PDB). Preparar la estructura mediante la eliminación de exceso de subunidades y luego añadir que faltan átomos de hidrógeno y disolvente explícita utilizando el "Neutralización de la célula y p K una predicción" experimento en YASARA 16. Para unidas a la membrana ciclasas triterpenos, las dimensiones adecuadas de la caja de agua son 91x67x77 Å. Ajuste el estado de protonación de los aminoácidos catalíticamente activos manualmente. Nota: Si es necesario, un análogo de sustrato en el archivo PDB puede ser modificado a un sustrato real utilizando la "Edición | swap | Atom" de comandos. Reducir al mínimo la estructura mediante el comando "Energía Minimización" utilizando la suite de campo de fuerza AMBAR 17. Utilice el enfoque Ewald malla de partículas (PME) 18 para dar cuenta de largo alcance interacciones electrostáticas. Establecer el límite para interacciones de van der Waals segúna la configuración estándar. Nota: El comando "Energía Minimización" elimina el estrés conformacional por una minimización corto descenso más pronunciado, a continuación, un recocido simulado (paso de tiempo 2 FSEC, velocidades atómicas escalados por 0,9 cada 10 ª etapa) se lleva a cabo hasta que se alcance la convergencia (es decir, la mejora de la energía por menos de 0,012 kcal / mol por átomo durante 200 pasos). 2. Modelo de solvatación sitio activo y Acceso al agua Después del recocido simulado, ejecutar un 20 dinámica molecular NSEC (MD) trayectoria y generar por lo menos 10 instantáneas por el "Archivo | Simulación Snapshot | Guardar como" comando seguido de "Simulación On". Ejecute las simulaciones en una computadora estándar con condiciones de contorno periódicas en el marco del conjunto canónico. Se mantiene la temperatura a 298 K usando un termostato Berendsen. Preparar las instantáneas obtenidas de 2,1 mediante la supresión de todas las moléculas de agua y ligandos eventuales / sustratos utilizando el4; Editar | Eliminar | Residuo "comando Superpose cada instantánea de forma individual en la estructura PDB original de la". Superpose | comando Objeto "para garantizar que todas las estructuras comparten la misma posición espacial Ahorra cada instantánea preparado de esta manera como un nuevo anteproyecto de presupuesto. -file (utilizando el "Archivo | Guardar como | AP" de comandos). Nota: Para los modeladores experimentados: escribir un script para automatizar este proceso de acuerdo con la plantilla dada en el Código complementario Archivo 1. Utilice las instantáneas preparadas (PDB) de 2.2 que se han alineado en 3D-espacio como entradas al CAVER software 3.0 19. Para el análisis de un número limitado de instantáneas, ejecute CAVER en un equipo estándar. Utilice un radio de sonda de 0.7 Å 19 para asegurar la detección de túneles que son específicas para el transporte de moléculas de agua. Visualice los túneles generados por CAVER 3.0 en un software de gráficos molecular. Para facilitar la visualización de los túneles, utilice la macro se muestra en Código suplementario File 2. 3. En Silico Enzima Ingeniería para modificar los patrones de agua y la dinámica del agua Identificar los túneles de más alto rango de acuerdo con el encabezado "ID" que figuran en el archivo de salida "summary.txt" generado por el software CAVER 3.0. Identificar aminoácidos que recubren los túneles de más alto rango (3.1) y que muestran una pequeña cadena lateral que señala hacia el interior del canal mediante inspección visual (usando el modelo obtenido a partir de 2,4). Identificar las sustituciones de aminoácidos individuales que bloquean el túnel por el aumento de impedimento estérico con el comando "Residuo de intercambio". Verifique que el túnel está obstruida por inspección visual, y luego repitiendo los pasos 1.2 a 3.1 del protocolo. 4. Expresión de los genes mutados Introducir mutaciones en el gen de tipo salvaje mediante mutagénesis por PCR usando cebadores que no se solapan 20. Añadir ADN plásmido que contiene el gen de interés al tubos con células competentes de una cepa de clonación adecuado y se incuba en hielo durante 30 min. Realizar una transformación de choque térmico durante 45 segundos en un baño de agua con la temperatura ajustada a 42 ° C. Añadir 500 l de un medio rico fresco (2YT, 16 g / L de triptona, extracto de levadura 10 g / L, 5 g / L NaCl) y se incuba a 37 ° C, 200 rpm durante 45 min. Realice una selección en placas las células transformadas en placas de agar suplementadas con los antibióticos apropiados. Después de verificar la secuencia de ADN del gen mutado, transformar el ADN de plásmido en una cepa de expresión utilizando choque térmico como se describió anteriormente. Para la expresión de unidas a la membrana ciclasas triterpénicos, utilice BL21 (DE3). Iniciar un cultivo de 5 ml O / N a 37 ° C de la cepa de expresión en 2YT-media suplementado con los antibióticos apropiados. Inocular un matraz de agitación desconcertado 2 L, que contiene 300 ml 2YT-medio suplementado con los antibióticos adecuados, a una DO final de 0,05 a 0,09 (medida a 600 nm). Después de la inducción a una DO de 0,6-0.8 y expresión de proteínas, congelar el sedimento celular y se almacena a -80 ° C. Para ciclasas triterpénicos unidas a la membrana en un vector pD861, inducir con 0,5 a 2 mM ramnosa y 4 hr de expresión a 37 ° C para lograr altos rendimientos de proteína de 21. 5. membrana de extracción usando una centrífuga normal y Protein Purification Preparar los siguientes tampones: tampón de resuspensión (fosfato de potasio 100 mM, pH 7,5 suplementado con inhibidor de la proteasa Tablets), tampón detergente (1% (v / v) de Triton X-100, fosfato de potasio 50 mM, pH 7,5) y tampón de reacción (0,2 % de Triton X-100, fosfato de potasio 50 mM, pH 7,5). Para ciclasas escualeno-hopene u otras enzimas unidas a la membrana con un óptimo de pH más bajo, sustituya el fosfato de potasio en el tampón de resuspensión con citrato. Para tales enzimas utilizar los tampones siguientes: tampón detergente (1% de Triton X-100, Citrato 60 mM, pH 6,0) y tampón de reacción (0,2% de citrato mM Triton X-100, 60, pH 6,0). Nota: Si un His-tag se utiliza para la purificación, complementar el tampón de resuspensión con imidazol 20 mM (concentración final). Pesar un sedimento celular congelado en un vaso de precipitados de vidrio. Resuspender las células en tampón de resuspensión usando un homogeneizador a una concentración final de 0,3 g de células / ml. Lisar las células resuspendidas por ultrasonidos con una amplitud de 80% y un pulso de 1 seg y 1 seg en off. Utilice tres ciclos de repetición de 50 seg cada uno. Añadir tampón detergente hasta una concentración final de 0,2% (v / v) de detergente. Equilibrar mezclando a 4 ° C durante 1 hr de extremo a extremo. Recuperar la fracción de proteína de membrana por el ahorro el sobrenadante después de una única etapa de centrifugación a 39.000 xg durante 50 min a 4 ° C. Nota: Si se utiliza la purificación His-tag, añadir aproximadamente 1,5 ml de agarosa Ni-NTA células / g y se incuba durante 1 hr. Realizar una primera depuraciónpaso por cualquiera de intercambio iónico o purificación 21 Su-etiqueta. Suplemento el equilibrado y elución tampones con 0,2% Triton X-100. Se concentra la proteína purificada cinco veces usando Filtrar Unidades centrífugas con un punto de corte de 10 kDa. Nota: El tamaño de las micelas resultados Triton X-100 en una concentración de detergente a una concentración final de aproximadamente 1%. Finalizar la purificación por filtración en gel un paso de pulido utilizando la proteína concentrada y una matriz compatible con un intervalo de fraccionamiento de las proteínas globulares de 2 × 10 × 10 4 -8 6. Utilice el tampón de reacción como tampón. Medir la cantidad de proteína purificada utilizando el kit Ultra Bradford de acuerdo con el protocolo del fabricante. 6. Cinética Hacer una nueva mM solución 5 stock de sustrato en tampón de reacción. Obtener una emulsión homogénea por ultrasonidos a 30% de la amplitud de 2-5 minutos. Equilibrar una termomezcladora la temperatura de reacción deseada. Verifique la temperatura dentro de un frasco de cristal que contiene agua con un termómetro externo. Para la cinética-sustrato único, diluir el sustrato emulsionado en al menos cinco viales de vidrio a la misma concentración de sustrato final. Por una olla cinética relativos con múltiples sustratos, preparar al menos cinco viales de vidrio idénticas mezclando todos los sustratos en cada vial. Para triterpenos hidrófobos, utilizar concentraciones de sustrato finales en el rango de 10 a 200 mM. Preincubar los viales de vidrio en el termomezclador durante 10 min. Se inicia la reacción mediante la adición de la enzima. Un volumen de reacción total de 1 ml es adecuado. Utilice una velocidad de agitación de al menos 1.200 rpm. Alto a las reacciones en diferentes puntos de tiempo mediante la adición de 500 l de acetato de etilo claveteado con 100 decanol M como un estándar de integración. 7. Extracción y Análisis termodinámico Extracto de las mezclas de reacción porvórtex y agitando manualmente los viales de vidrio vigorosamente durante 1 min. Centrifugar los viales de vidrio en 9600 xg en una centrífuga de mesa durante 10 minutos a temperatura ambiente. Transferir la capa superior (fase orgánica) a un tubo vacío. Añadir un adicional de 500 l de disolvente de extracción de los tubos de reacción y repita el procedimiento de extracción. Seque las mezclas de reacción se extrae con Na 2 SO 4. Vortex durante 5 segundos y dejar los tubos descansar durante 10 minutos. Realice una etapa de centrifugación final a 9.600 xg durante 1 min a temperatura ambiente utilizando una centrífuga de mesa. Transferir las muestras extraídas de cromatografía de gases (GC) viales. Repetir los pasos bajo 6.1 a 7.2 para cada variante enzima de interés, utilizando al menos cuatro concentraciones diferentes inicial del sustrato (por la cinética de sustrato individuales) y cuatro temperaturas diferentes (tanto para un solo sustrato y la cinética competitivos). Realizar GC-análisis a lo descrito previamente 3. Utilice una columna no polar para el análisis de hydrophobic productos pentacíclicos. Ajustar la temperatura inicial de la estufa a 120 ° C y el uso de un gradiente de temperatura de 5 ° C / min, dependiendo de los productos y la columna. Integrar las áreas de los picos del producto (s) y transformar áreas de los picos del producto en las concentraciones de productos correspondientes mediante la utilización de la zona de la norma de integración (correspondiente a 100 mM). Trazar la concentración de cada producto ([P]) versus el tiempo de reacción (t). Realizar regresión lineal de los puntos de datos correspondientes a la conversión de menos de 10%. La velocidad de reacción inicial (V 0) viene dada por la pendiente de la línea ajustada de acuerdo a: Nota: Por una olla cinética relativos con múltiples sustratos, V 0 es la velocidad inicial de un sustrato particular bajo la influencia de otros sustratos. Para la cinética de sustrato individuales, parcela V 0 </sub> / [E] en contra de las concentraciones de sustrato correspondientes. La aparente k cat / valor de K M está dada por la pendiente de la parte lineal de la gráfica de acuerdo a: [S] es la concentración de sustrato y [E] la concentración de enzima utilizada en la transformación. K cat / K M equivale a la constante catalítica sobre la constante de Michaelis. Repetir el análisis para cada temperatura y cada variante de la enzima. Para la cinética de sustrato individuales, realizar un análisis termodinámico de acuerdo con la teoría del estado de transición 22 k b es la constante de Boltzmann, constante h, T de Planck de la temperatura en grados Kelvin, y R la constante de los gases. Realizar un análisis de regresión lineal de la trama de ln ((k <sub> cat / K M) / ((k b * T) / h))) frente a 1 / T. La entalpía de activación (Δ H ‡) viene dada por (-Pendiente) * R y la entropía de activación (Δ S ‡) viene dada por (el origen) * R. Nota: Del mismo modo, un análisis bajo la concentración de sustrato saturante se puede realizar mediante el uso de k gato como tasa constante en la ecuación 3. Por una olla cinética relativos con múltiples sustratos, obtener la aparente relación k cat / K valores de M de 23: (K cat / K M) A / (k cat / K M) B = V 0, A / V 0, B * [B] / [A] (4) para los que V 0, A se refiere a la tasa inicial de sustrato A en competencia con el sustrato B. Para un solo recipiente ki relativanetics con múltiples sustratos, obtener los parámetros termodinámicos relativos de activación para B, en comparación con A como referencia, por regresión no lineal: Calcular los parámetros de activación absolutos de sustrato B de la entalpía de activación y la entropía del compuesto de referencia A: