Voorbereiding van mitochondriaal verrijkte fracties voor Metabole analyse in<em> Drosophila</em
Summary
Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.
Abstract
Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions.
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.
Introduction
Het doel van deze procedure is om verrijkte mitochondriale fracties die voldoende mitochondriale metabolieten opleveren voor metabolomics studies met behulp van Drosophila melanogaster ontwikkelen. In onze ervaring, metabolomics analyse met behulp van hele cellulaire extractie methoden zijn niet in staat om subtiele mitochondriale metaboliet veranderingen in Drosophila detecteren. Echter, mitochondriale fractionering vóór metabolomics analyse verhoogt de gevoeligheid voor mitochondriale metaboliet verschuivingen identificeren.
Mitochondriën zijn cellulaire organellen verantwoordelijk voor 90% van de energie die de cellen nodig voor normale functie 1. De laatste jaren is erkend dat mitochondriën een veel dynamischer rol in cellulaire en organismale functie van alleen de productie van adenosine trifosfaat (ATP), en worden nu erkend als knooppunten voor de regulering van metabole homeostase 2,3. Mitochondriën zijn het resultaat van een proces waarin endosymbiotic distinct microbiële lijnen samengevoegd ~ 1,5 miljard jaar geleden 4. Zoals mitochondriën uitgegroeid tot ware organellen, werden genen van de endosymbiont opgenomen in de opkomende nucleaire genoom. Bij dieren vandaag ongeveer 1500 mitochondriale eiwitten nucleair gecodeerd terwijl 37 genen blijven de mtDNA, 13 die coderen voor mitochondriale eiwitten die subeenheden van het enzym complexen van oxidatieve fosforylering 5. Coördinatie tussen mitochondria en nucleaire compartimenten nodig om een goede mitochondriale functie te behouden.
Volgens de hieronder beschreven werkwijzen konden we mitochondriale metabole veranderingen in Drosophila als gevolg van manipulatie van de coördinatie van mitochondriale en nucleaire genoom te detecteren. Gebruikten we een stam van Drosophila waarin mtDNA van haar zus soorten D. simulans werd op een enkele D. geplaatst melanogaster nucleaire achtergrond 6. Deze 'verstoord' mitonucleargenotype vergeleken met de "natieve" of co-geëvolueerde mitonuclear genotype van D. melanogaster dragen dezelfde nucleaire genoom met zijn inheemse D. melanogaster mtDNA. De D. en D. melanogaster simulans mtDNAs verschillen ~ 100 aminozuren en> 500 synoniem substituties die mitonuclear communicatie 7,8 beïnvloeden. We gegenereerd hele fly extracten en mitochondriale verrijkte extracten metaboliet verschuivingen studeren in reactie op farmacologische stress. Hier laten we zien dat bij het gebruik van mitochondriale verrijkte fracties op te sporen we duidelijke verschuivingen in het mitochondriaal metabolieten tussen de inheemse, co-geëvolueerd genotype dragen van de D. melanogaster mtDNAs en de verstoorde genotype dragen D. simulans mtDNA. In tegenstelling, de metaboliet verschillen tussen beide genotypes subtiele met normale werkwijzen die hele fly extract gebruiken. Daarom is deze werkwijze verschaft een weg te begrijpen hoe mtDNAs bemiddelen mitochondriale veranderingenreactie op verschillende drugs.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest kritische stappen in dit protocol zijn: 1) het grootbrengen genoeg vliegen in een overvloed aan ruimte. Het is zeer belangrijk om niet de demografie kooien met meer dan 150 vliegen per overpopulate; 2) het veranderen van het voedsel van de kooien vaak om voedsel concurrentie en voedingswaarde stress te vermijden; en 3) het handhaven van alle monsters bij 4 ° C om de integriteit te verzekeren tijdens de isolatie van de mitochondriale fractie. Het wordt ook aanbevolen om de isolatie buffer, het wassen buffer, en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Adelphi University faculty development grant and grant R15GM113156 from NIGMS awarded to EVC, grant R01GM067862 from NIGMS and grant R01AG027849 from NIA awarded to DMR.
Materials
| 0.2% tegosept -methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCL | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 liter cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 liter cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filter flask | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
References
- Scheffler, I. E. . Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , 484 (2007).
- Guarente, L. Mitochondria–a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins. Cell. 132 (2), 171-176 (2008).
- Raimundo, N. Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory. Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).
- Embley, T. M., Martin, W. Eukaryotic evolution, changes and challenges. Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).
- Lane, N., , . Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life. 368, (2006).
- Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila. Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).
- Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila. Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).
- Zhu, C. -. T., Ingelmo, P., Rand, D. M. G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity. PLoS genetics. 10 (5), e1004354 (2014).
- Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells. SpringerPlus. 3, 254 (2014).
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material. Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
- Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology. Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).
- Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics. PloS one. 7 (3), e33020 (2012).
