인공 와우 세포 변성을 유도하기위한 신속하고 신뢰할 수있는 기술 : Ototoxic 에이전트 배달을 위해 마우스 라운드 창 접근
Summary
Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.
Abstract
Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.
Introduction
수사관들은 청각 시스템의 정상적인 기능뿐만 아니라 청력 손실의 병태 생리를 연구하는 동물 모델의 광범위한 배열을 사용했다. 이러한 모델은 다양한 병리학 적 과정에 대한 개입 연구를 수행하기위한 매우 유용하며 인체에 번역 응용 프로그램에 대한 기초 역할을합니다. 달팽이관과 연관된 청각 경로를 포함하는 대부분의 연구, 손상 또는 파괴의 정도는 몇몇 시스템에 도입해야한다. 종종 손상 의도적 연구자들은 정상적인 기능에 해당 병변뿐만 아니라 그것을 복구하는 능력 달팽이관의 효과를 연구 할 수 있도록, 특정 병변을 생성하는 것을 목표로한다. 데미지를 도입하기위한 특정 동물 모델 및 / 또는 기법 (들)을 선택했을 때, 여러 가지 요인이 최상의 결과를 달성하기 위해 고려되어야한다. 기술의 직접 및 간접 효과가있을 수 있지만 다양한 동물 모델은, 개입에 다르게 반응 할 수있다원하는 결과에 전적으로 해로운. 대부분의 경우에, 이상적인 내이 손상 프로토콜은 빠르게, 전신 독성을 방지하고 신뢰성을 손상 제조, 정밀하고 일관된 병변을 생성하고, 기능적인 세포와 분자의 변화의 추가적인 연구를 허용하기에 존속 할 것이다. 이상적으로, 이러한 방법은 가능한 최대 범위 달팽이관의 섬세한 마이크로 아키텍처 및 전기 화학적 구배를 유지한다.
지금까지 연구자 내이 손상을 유도하기 위해 다수의 기술을 확립에 성공 하였다. 이들의 대부분은 중 전신 또는 수술 적 접근을 통해 ototoxic 에이전트 달팽이관을 노출 수반한다. 기술은 perilymphatic 관류와 비경 주입, 복강 내 주사, 트랜스 고막 주사, 림프 낭 주입 및 cochleostomy을 포함한다. 이들 기술은 푸로 세 미드, 겐타 마이신, 인 ouabain 및 헵탄 등 ototoxic 제제의 다양한 도입하는데 사용되어왔다. 1-5특정 인공 병변 생성에 성공하지만, 상기 기술들은 제한을 인정하고있다. 전신 주사는 동물을 매우 독성이 될 수 있고, 의도하지 않은 인공 욕설과 일치 결과와 연관 될 수있다. 후자의 단점은 트랜스 고막 주사와 관련이있다. 이러한 cochleostomy 및 perilymphatic 관류 같은 기술은 신속하고 신뢰성이 높은 병변을 유도 할 수있는 반면, 내이의 구조와 기능에 직접적으로 침입한다. 수술 방법의 대부분은 기술적 인 어려움의 높은 수준과 관련된 및 마이크로의 주입기와 같은 동물의 이물질을 떠날 필요로 할 수있다. 2-4,6-8 단일 기술은 결점이없는없고, 연구자들은 선택해야합니다 방법은 신중하게 실험의 요구에 맞게. 여기, 우리는 구체적으로, 성인 마우스의 ototoxic 에이전트의 국소 전달을 위해, 둥근 창 틈새 (RWN) 응용 기술에 대해 설명합니다.
인터넷조류 모델 감각 머리 셀 변질 겐타 마이신의 효과를 연구하는 동안 처음 1998 년 알 Husmann 등에 의해 설명 된이 기술은 관련 독성을 피하면서, 전신 젠타 프로그램보다 훨씬 더 신뢰성있는 병변을 생성 할 수있는 것으로 밝혀졌다. (9) 그 후, 우리의 실험실을 포함한 다른 연구자의 수는 큰 성공에이 기술을 활용하고있다. 2004 년, HEYDT 등. 마우스 모델에 적합 화 및 겐타 마이신의 농도를 변화 배어 흡수성 젤라틴 스폰지 RWN를 충전함으로써 병변의 크기를 제어하는 향상된 능력을 설명했다. (10) 외., 2010, 베타 Bungarotoxin의 ototoxic 효과를 연구 팜 그렌, 유력한 대만의 독에 요소가 성인 쥐의 RWN에의 수성 형태를 적용하여, 상자를 줄무늬. (11) 또한, 우리 실험실에서 이전 연구의 수는 furosemid의 ototoxic 효과를 연구 할 수있는 둥근 창 접근법을 활용 한전자, 인 ouabain과 헵탄. 이러한 연구의 5,6,12-15 결과 인공 유체 및 정상 청력에 이온 항상성의 중요성을 증명하고있다, 나선 신경절 및 인공 측면 벽에서 세포 증식 능력을 발견하고, 우리의 이해를 발전했다 노인성 난청.
다음 방법은 수술 후이 절개하고 뼈 고막의 수포의 부분 unroofing을 통해 중이에 액세스하는 것을 포함한다. 이것은 선택된 ototoxic 에이전트가 직접 적용될 수있는 RWN와 막의 우수한 노광을 허용한다. 액체 에이전트 다음 RWN의 컵 모양의 중공의 풀 (또는 천천히 RWN로 포장 포화 흡수성 젤라틴 스폰지 캐리어에서 배수) 및 인공 현관의 perilymphatic 공간으로 둥근 창 막을 통해 확산. 직접적인 cochleostomy이 접근 방식에 이루어지지 않습니다. 이 기술의 장점은 내이 마이크로 아키텍처, 회피의 보존을 포함내 동물 관리 귀 전신 독성, 수당, 효과 빠른 시작, 특정 인공 세포 유형에 선택적 변성 (예., I 형은 ouabain과 노출과 인공 형 헵탄의 치료에 의해 유도 II 섬유 세포와 신경절 신경 세포 나선형), 및 재현 / 신뢰할 수있는 결과. 이 기술은 래트, 기니아 피그 및 모래 쥐를 포함하여 다른 설치류 사이 약간 변경하여 적용 할 수있다. 단점은 가파른 기술 학습 곡선과 시간에 하나의 점으로 제한됩니다 ototoxic 모욕의 상대적 제한이 포함됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
상기 프로토콜 및 대표적인 결과는 남녀 모두 포함 CBA / CAJ 마우스 모델에서 얻어졌다. 이 근친 변형이 잘 연구를 듣고 "좋은 청력"표준 "정상적인 노화"모델로 설정됩니다. 다른 포유 동물 모델에이 프로토콜의 사용의 16 ~ 23 설명이 텍스트의 범위를 벗어납니다. 독자는 RWN 응용 기술은 포유류의 내이 공부에 여러 가지 이점을 제공한다는 점에 유의해야한다. 이들 중에서 가장 두드러진은 민감한 해부학 적 구조를 직접 파괴 및 귀 캡슐의 벽 내에 존재하는 생화학 적 구배를 피할 수 있다는 점이다. 이러한 cochleostomy 및 주입 펌프의 주입 등의 절차는 직접 영구 임계 값의 변화를 선도하는 내이 구조를 위반하는 경향이있다; 결과를 분석 할 때 고려되어야 사실. 침략 운전 방식에 의한 인공 측벽 구조의 중단DS는 또한 특정 영역 효과의 위치로 제한됩니다. 이러한 트랜스 고막 주사와 정맥 주입 15,24 대체 비 침습적 방법을 신뢰할 수없는 결과에 의해 괴롭혀 된 푸로 세 마이드 또는 헵탄 등 ototoxic 에이전트의 사용을 제한 할 수있다 / 또는 동물 모델에 전신 독성. 이 도포 방법은 상술 침습적 방법의 접근 일관성의 레벨을 달성 이러한 단점을 모두 방지 입증되었다.
이 기술의 또 다른 장점은 동물 모델과 가능성의 수에 넓은 적용이 기존의 실험실 인프라에 통합되어 있습니다. 후자에 대해 어떠한 전문 시약이나 화학 물질이 선택한 ototoxic 제, 마취제 및 진통제 제외하고 필요하지 않습니다. Ototoxic 화제는 전형적으로 고려 장시간 지속하는 용액 (5 ㎖)의 충분한 양의 고정 농도로 사용하고 혼합각 응용 프로그램을 보내고하면 (마우스) 10 μl를 사용합니다. 따라서, 소모품 및 기기의 초기 구매 후, 연구자들은 시간이 소요 솔루션 준비 또는 재료의 잦은 교체에서 상대적으로 자유 롭다. 이 기술은 또한 perilymphatic 주입 펌프 또는 cochleostomies의 주입을 포함하는 절차에 비해 중요 할 수 있습니다 수술 시간의 감소를 제공합니다. 기술적 능력의 레벨에 도달하면, 고정 초기 절개에서 우리의 평균 완료 시간 ototoxic 에이전트 원하는 노출의 길이에 따라 일반적으로 20 분 내지 1.5 시간이었다. 세 가지 또는 네 개의 수술은 쉽게 효율성 향상 및 성공적인 결과를 얻기위한 증가 가능성을 허용, 단 하루 만에 완료 할 수있다. 전술 한 바와 같이,이 기술은 또한 쉽게 마우스, 래트, 기니아 피그 및 모래 쥐 설치류를 포함한 다양한 모델에 적용될 수있다.
이 방법의 한계에 집중되어적당히 가파른 학습 곡선을 습득하는데 필요한 기술적 능력에 도달 할 때까지 기대되는 결과를 감소. 아래에서 더 상세히 논의되는 바와 같이, 외과 수술 방식 또는 필드의 불충분 시각화하는 동안 작은 오류는 거의 변함 불량한 결과로 이어질 것이다. 이러한 에이전트를 희석 둥근 창 막 또는 간질 액에 에이전트의 서브 밀리미터 두께의 기포 차단 액세스와 같은 초보자가 인식하지 못할 수 있습니다 미묘한 결과는 감사하고 해결하기 위해 필요한 정신 능력을 개발하는 데 시간이 걸릴. 그러나 이러한 장애물을 쉽게 극복하고 상기 침습적 방법 중 일부에 비해 연구자에 덜 어려운 기술적 과제를 구성하는 절차의 반복되는 성능. 마지막으로,이 방법은 인공 와우 부상에서만 수술 중에 노출 시간에 단일 지점에서 발생 될 수있는 상대적으로 한계와 연관된다. 이것은 어느 정도 극복 될 수있다, HEYDT 등에 의해 설명 된 바와 같이 제 배어 흡수성 젤라틴 스폰지 RWN 채워서. 10 흡수성 젤라틴 스폰지는 시간에 재 흡수되지만, 단독으로 수용액의 적용을 통해 달성 가능한 것보다 더 긴 노출 기간을 허용 할 수있다.
이 기술의 모든 이점을 인식하고 함정을 피하기위한 조사자 위해,이 기술의 두 핵심 요소가 인식하는 것이 중요하다 : 1)로 일관 중이 공간 RWN 시각화 유지하는 단계; 2) 능력 간질 액 및 / 또는 혈액의 무료 수술 필드를 유지합니다. 이들의 전 달성을, 적절한 헤드 홀더의 중요성이 강조 오버 될 수 없다. 동물의 머리를 안전하게 고정은 현미경 안정적인 전망을 보장; 미묘한 기기가 급격히 확대 하에서 구조의 위치가 변경 될 때의 중요성은 쉽게 명백해진다. 좋은 시간동물의 주동이의 – 꼬리 축을 중심으로 회전 할 수 EAD 홀더는 사이트의 조사의 라인에서 중요한 동적 변경을 용이하게한다. 종종,이 축을 중심으로 회전 몇 밀리미터 RWN 시각화 만 귀 캡슐 뼈 시각화의 차이를 의미 할 수있다. 계속보기를 변경하는 기능도 제대로 틈새와 깊이에서 제거 간질 액을 보장하는 가장 중요 또한 우리의 경험, 혈액, 응축, 또는 간질 액에서 제 5 부에서 논의 된 바와 같이 ototoxic 에이전트는 완전히 응용 프로그램 사이에 제거됩니다 즉 중이 공간은 전체 실험을 방해하는 기능을 가지고 들어간다. ototoxic 에이전트의 작은 양이 쉽게 외부 유체의 아주 작은 볼륨으로 접촉에 의해 희석 될 수있는 둥근 창 (~ 10 μL)에 적용 이것은 놀라운 일이 아니다. 이 때문에, 세심한 수술 해부, 고막 수포 및주의 preservat의 단편 uncappingstapedial 동맥의 이온은 성공적인 실험 결과와 동등하다.
위의 중요한 단계는 관찰과 예상 결과는 아직 달성되지 않은 경우, 문제 해결을 시작해야합니다. 우리의 경험에 의하면, 두 개의 절차 적 요소의 시험 변형을 수행하는 것이 도움이된다. 첫째는 ototoxic 에이전트 둥근 창 보충되는 빈도를 변경하는 것이다. 사용되는 에이전트에 따라 총 노출 시간은 완전한 위킹 및 제 매 10 분 이후 여분으로, 30 분 및 1 시간 사이이다. 짧은 기간에 대한 노출되면, 전체의 노출을 증가시키는 것은 에이전트 더 많은 시간이 둥근 창 막에 걸쳐 확산 할 수있다. 추가 노광 및 보충 또한 전술 한 바와 같이 혈액, 축합 또는 간질 의해 ototoxic 제의 불필요한 희석을 방지하는 데 도움이된다. 이 방법을 사용할 때 부주의의 위험을 증가시키는 경향으로주의 그러나 유지되어야LY는 stapedial 동맥 부상 및 / 또는 RWN에 간질 액을 소개합니다.
이 기술은 인공 생리 및 병태 생리의 조사에 제공하는 것에에서 중요하다. 이러한 최소 침습 기술은 섬세한 생화학 적 과정의 상세한 연구를 허용하고 인공 회생 가능성을 평가할 목적으로 연구를 발전에 동등했다. 12, 24이 수술 방법과 노출 또는 다른 파생 기술의 다양한 통해 재생되고, 성공적인 결과는이를 이용 방법은 인공 줄기 세포 주입의 연구에서보고되고있다. (14) 많은 그러나, 연구자가 사용할 수있는 넓은 필수품 전반과 함께이 기술은,이 기술 격차를 좁히는 데 도움이됩니다, 달팽이관에 대한 알 수없는 남아 있습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (NIH) Grant number: NIH P50DC00422 (H.L.); NIH R01DC12058 (H.L.). This work also benefitted from the South Carolina Clinical and Translational Research Institution (SCTR) Clinical and Translational Science Award (NIH/NCRR UL1RR029882). The funders had no role in study design, data collection, and/or analysis. The authors would like to thank Lonnie E. Brown Jr. for his artistic and graphic contributions.
Materials
| 1-Heptanol 98% | Sigma-Aldrich | H2805 | PubChem Substance ID 24895536 |
| 250ML | |||
| Ketaset Injectable | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Concentrate 100mg/ml |
| (Ketamine HCl) | 10ml | Schedule CIII controlled substance | |
| Anased Injectable | Lloyd Laboratories | NADA# 139-236 | Concentrate 20mg/ml |
| (Xylazine) | |||
| Buprenex Injectable | Patterson Veterinary | 07-850-2280 | Concentrate 0.3mg/ml |
| (Buprenorphine HCl) | 5 ampules per box | Schedule CIII controlled substance | |
| Betadine Skin Prep Solution | Medline | MDS093941 | 1 Quart screw top bottle |
| (Povidone-Iodine) | |||
| 0.9% Sterile Saline | Variable | N/A | For mixing solutions and injections |
| Table of Equipment, Surgical Instruments, and Specific Techniques | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | 32192 | |
| Controlled Acoustics Environment Sound Booth | Industrial Acoustics Company | N/A | |
| Surgical Head Holder | Custom Made – | Please see Figure 3 | |
| Medical University of South Carolina | |||
| Neck Soft-Tissue Retractor (Wire Speculum, Titanium) 1.75inch | World Precision Instruments | 555801L | Maximum spread 20mm |
| Embedded in disposable putty to affix dynamically to head holder | |||
| 90N Dental Belt Driven Hand Drill | Emesco | N/A (Vintage Item) | |
| Scalpel Handle Size6 | Bard-Parker | MEDC-011990 | |
| #15c Stainless Steel Surgical Scalpel Blade | Bard-Parker | SKU: 097-7215 | 50 Blades/Box |
| Via ACE Surgical Supply Code | |||
| Straight Tip Jewelers Forceps | Bernell | MIL17304 | |
| Iris Scissors Curved | Medline | DYND04026 | |
| Iris Scissors Straight | Medline | DYND04025 | |
| Stevens Tenotomy Scissors Straight | Medline | MDG3222111 | |
| Rosen Ear Needle Straight Shaft, Lightly Curved Tip | MytaMed | Item# 6.56.00 | Figure 1 demonstrates angled shaft picks. This was later substituted for the Rosen picks |
| Rosen Ear Needle Straight Shaft, Strongly Curved Tip | MytaMed | Item# 6.56.01 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech Science | CODE 34155 | White, Size 4.4×8.4 Inch. Cut to triangles and rolled into fine tip wicks. |
| House Ear Curette, 6” shaft, light angle | Medline | MDG0396486 | |
| Gelfoam (absorbable gelatin sponge) Size 100 | Medline | IIS34201 | Substitutions may be made |
| Cotton pellets #3 4mm | Richmond | Manufacturer Code 100108 | |
| ElectroSurgical Unit 100 E M/M | Elmed | List No. 52-5770 | Bipolar and Monopolar Capable |
| 1cc U-100 Insulin Syringe 28G, 0.5” length needle | BD | Product Number: 329410 | Optional for delivery of Ototoxic agent |
| 23G, blunt tip, 1” length needle | Kendall | Product Code 8881202397 | For controlled delivery of Ototoxic agent with less risk of damaging stapedial artery |
| Surgical Mask | U-line | S-10478 | |
| Exam Grade Nitrile Surgical Gloves | U-line | S-12549 | |
| Precision Hair Clippers | Wahl | N/A | Multiple models may be substituted |
| 5-0 Nylon black monofilament suture on PC-1 13mm 3/8 circle needle | Ethilon | 1855G | Substitutions may be made. |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisher | 01-812054 | |
| Dry Sterilizer | ROBOZ | Germinator TM 500 | |
References
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