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医学

L'approccio del mouse Round-finestra per ototossico Delivery Agent: Una rapida e tecnica affidabile per indurre la degenerazione delle cellule Cochlear

Published: November 26, 2015
doi:
10.3791/53131
, , ,
1Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,Medical University of South Carolina, 2Department of Pathology and Laboratory Sciences,Medical University of South Carolina, 3Intuitive Surgical, Inc

Summary

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

Abstract

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Introduction

Gli investigatori hanno utilizzato una vasta gamma di modelli animali per studiare la funzione normale del sistema uditivo e la fisiopatologia della perdita dell'udito. Questi modelli sono anche molto utili per lo svolgimento di studi di intervento contro vari processi patologici e servono come base per le applicazioni traslazionali in soggetti umani. Per la maggior parte della ricerca che coinvolge la coclea ed i suoi percorsi uditivi associati, un certo grado di danno o rottura deve essere introdotto nel sistema. Spesso, il danno è intenzionalmente prova a creare una lesione specifica, consentendo ai ricercatori di studiare l'effetto di tale lesione sulla normale funzione, così come la capacità cocleare di recuperare da esso. Quando si seleziona un particolare modello animale e / o tecnica (s) per introdurre danni, un certo numero di fattori devono essere considerati per ottenere i migliori risultati possibili. Vari modelli animali possono rispondono in modo diverso agli interventi, mentre gli effetti diretti e indiretti di una tecnica può essereinteramente deleterio per il risultato desiderato. Nella maggior parte dei casi, il protocollo danni orecchio interno ideale sarebbe evitare tossicità sistemica, rapidamente e produrre in modo affidabile danni, creare una lesione precisa e costante, ed essere sopravvivere per consentire un ulteriore studio delle variazioni funzionali, cellulari e molecolari. Idealmente, questi metodi potrebbero anche preservare i delicati microarchitettura e elettrochimici pendenze della coclea, per quanto possibile.

Fino ad oggi, i ricercatori sono riusciti a stabilire una serie di tecniche per indurre lesioni dell'orecchio interno. La maggior parte di queste comportano esporre la coclea di un agente ototossica sia sistemica o attraverso approccio chirurgico. Le tecniche includono iniezione parenterale, iniezione intra-peritoneale, iniezione trans-timpanica, iniezione sacco endolinfatico, e cocleostomia con perfusione perilinfatico. Queste tecniche sono state usate per introdurre una varietà di agenti ototossici quali furosemide, gentamicina, ouabain e eptanolo. 1-5Mentre successo a creare lesioni cocleari specifiche, le tecniche sopra anche hanno riconosciuto limitazioni. Iniezioni sistemici possono essere altamente tossici per l'animale e possono essere associati con insulti cocleari non intenzionali e risultati inconsistenti. Quest'ultima lacuna è stata anche associata con iniezioni di trans-timpanica. Tecniche come cocleostomia e perfusione perilinfatica, mentre in grado di indurre lesioni rapide e altamente affidabili, sono direttamente invasivo per struttura dell'orecchio interno e la funzione. Molti degli approcci chirurgici sono anche associati con un alto grado di difficoltà tecnica e possono richiedere lasciando oggetti estranei nella animale, come un infusore micropompa. 2-4,6-8 Nessuna singola tecnica è libera di difetti, e gli investigatori devono scegliere metodi accuratamente per soddisfare le loro esigenze sperimentali. Qui, descriviamo in dettaglio, la finestra di nicchia rotonda (RWN) tecnica di applicazione per la consegna topica di agenti ototossici in topi adulti.

Fiprima descritto da Husmann et al nel 1998 studiando effetto di gentamicina sulla sensoriale degenerazione cellulare capelli in un modello aviario, questa tecnica è stata trovata per essere in grado di produrre lesioni significativamente più affidabili rispetto all'applicazione gentamicina sistemica, evitando tossicità. 9 Da allora, numero di altri ricercatori, tra cui il nostro laboratorio, hanno utilizzato questa tecnica per un grande successo. Nel 2004, Heydt et al. adattato ad un modello di topo e descritta una maggiore capacità di controllare le dimensioni della lesione riempiendo il RWN con assorbibile spugna di gelatina imbevuto in concentrazioni variabili di gentamicina. 10 Palmgren et al., nel 2010, hanno studiato gli effetti ototossici di beta-bungarotossina, un potente elemento nel veleno dei taiwanesi banded cassa, mediante l'applicazione di una forma acquosa al RWN di ratti adulti. 11 Inoltre, un certo numero di studi precedenti ottenuti nel nostro laboratorio hanno utilizzato l'approccio finestra rotonda per studiare gli effetti ototossici di furosemidee, ouabain, e eptanolo. 5,6,12-15 I risultati di questi studi hanno dimostrato l'importanza di fluido cocleare e l'omeostasi di ioni in un udito normale, scoperta cellula capacità proliferativa nel ganglio spirale e parete laterale cocleare, e favorito la nostra comprensione di età-correlate perdita di udito.

L'approccio seguito consiste chirurgicamente accesso dell'orecchio medio tramite un'incisione retroauricolare e a decapitazione parziale del timpanica bulla ossea. Ciò consente un'ottima esposizione del RWN e la membrana a cui un agente ototossico selezionato può essere applicato direttamente. L'agente liquido poi piscine nel cavo a bicchiere del RWN (o lentamente drena da un vettore spugna di gelatina riassorbibile saturi confezionato in RWN) e diffonde attraverso la finestra della membrana intorno nello spazio perilinfatico del vestibolo cocleare. Nessun cocleostomia diretta è fatto in questo approccio. I vantaggi di questa tecnica sono la conservazione di dell'orecchio interno microarchitettura, evitamentodi tossicità sistemica, l'assegno di un controllo orecchio intra-animale, veloce insorgenza dell'effetto, degenerazione selettiva in alcuni tipi di cellule cocleare (ad es., di tipo I spirale neuroni gangliari con esposizione ouabain e tipo cocleare II fibrociti indotte dal trattamento di eptanolo), e / risultati affidabili e riproducibili. Questa tecnica può essere applicata con alcune modifiche tra le altre specie di roditori, tra cui ratti, cavie, e gerbilli. Svantaggi includono una curva di apprendimento ripida tecnica e la relativa limitazione di insulto ototossico che è costretto ad un singolo punto nel tempo.

Protocol

Tutti gli aspetti della ricerca sugli animali sono state condotte in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale adeguata cura degli animali e Usa. Tutte le procedure sperimentali su animali vertebrati qui descritti sono stati approvati in base alle direttive della Medical University di comitato (MUSC) Istituzionale cura degli animali e Usa della Carolina del Sud (IACUC). Selezione 1. Modello Mantenere il modello animale in un vivaio a basso rumore con custodia di routine per i protocolli istituzionali fino al momento dell'uso. Nella ricerca animale strutture (ARFs), mantenere la stabilità delle vibrazioni, il rumore di smorzamento, l'illuminazione diurna, lo spazio di preparazione, finiture di superficie, di tenuta e coibentazione e ventilazione in grado di soddisfare gli standard NIH. Nota: National Institutes of Health (NIH) linee guida per la ARFs e il mantenimento di un basso rumore vivaio possono essere riveduti su: http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/ Per tutti gli esperimenti, utilizzare l'orecchio destro come l'orecchio sperimentale. L'orecchio sinistro serve da controllo intra-animale e non viene alterata chirurgicamente. Controllare il modello animale pre-operatoria per segni di infezione medio o esterno dell'orecchio. Potenziali segni possono includere drenaggio del liquido o pus dall'orecchio, tessuto infiammato pinna, e / o letargia dell'animale. Questo è insolito, ma se osservato, evitare ulteriori interventi chirurgici e trattare l'animale in modo appropriato. 2. Procedure preoperatori Anestetizzare l'animale 30 min prima dell'intervento e procedure perioperatorie via intraperitoneale (IP) iniezione di ketamina (100 mg / kg IP) e xilazina (20 mg / kg IP). Supplemento anestesia se necessario, come giudicato da una punta pinch reflex positivo, con un dosaggio inferiore di ketamina (25 mg / kg IP) e xilazina (5 mg / kg IP). Determinare il dosaggio in conformità con i protocolli istituzionalmente consentiti per topi con età opportuni aggiustamenti del dosaggio. Controllare per la piena sedation del modello. Verificare la presenza di una fase 3 piano di anestesia per la totalità del protocollo descritto segnata da un tasso di respirazione normale, la mancanza del riflesso di raddrizzamento (nei topi), e la mancanza di pedale e palpebrale (toe-pinch) riflessi. Mantenere l'animale a questo livello di anestesia. Questo è fondamentale per la minimizzazione del dolore e del movimento intraoperatorio, sanguinamento, e la perdita di liquidi interstiziali durante l'intervento chirurgico. Mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37,5 ° C con una piastra elettrica a ciclo chiuso. Somministrare l'analgesia per via sottocutanea di buprenorfina. Invia buprenorfina (0,1 mg / kg una volta SQ 30 min prima della chirurgia) come analgesico per ridurre al minimo qualsiasi disagio chirurgica. Dosaggio di base e le alternative adatte al modello selezionato su protocolli istituzionalmente approvati. Antibiotici uso non è necessario se buona tecnica asettica è stata praticata. Gli animali ricevono analgesia post-operatoria se ci sono segni di dolore e angoscia. Eseguire phTest ysiologic prima dell'intervento. Esecuzione uditivo risposta tronco (ABR) prova e / o la distorsione prodotto test emissioni optoacustica (DPOAE) sia pre-operatorio e appena prima del sacrificio dell'animale serve come una misurazione oggettiva per l'effetto dell'agente ototossica scelta sulla uditiva del mouse. 3. Preparazione chirurgica e Posizionamento Sterilizzare tutti gli strumenti di pre-operatorio per gli standard istituzionali. Preparare strumenti chirurgici e campo in modo coerente, sterili, e organizzata per evitare sforzi inutili e il movimento durante la procedura. Tipici strumenti necessari include forbici dissezione taglienti, diverse paia di pinze metalliche con punte del gioielliere, un prelievo otologica, una curette otologica, e una unità di elettrocauterizzazione bipolare (Figura 1). Preparare e sterilizzare stoppini di carta a base di labwipes in anticipo, tagliando un pezzetto triangolare della wipe (~ 0,7 x 1,25 x 1.75 in) e torsione saldamente tra il pollice e l'indice di una mano (~ 1,25 in). Creazione di un strettamente intrecciato, stoppino estremamente sottile è fondamentale per il successo della procedura. Preparare un totale di 15-20 stoppini prima dell'intervento (Figura 2). Utilizzare un trapano dentistico per perforare rapidamente l'osso del bolla timpanica in modo controllato. L'utilizzo di un trapano a mano dentale a cinghia con una punta di 1 o 2 mm rastremato è preferibile. Un microscopio operatorio è necessario per completare il protocollo. (vedi punto 4.7) Pre-disegnare 0,2 ml di una soluzione acquosa contenente l'agente ototossica selezionato in una siringa da 1 ml con tubercolina 28 G, 1/2 'ago. Tipicamente 1 goccia (~ 10 ml) dell'agente è sufficiente a riempire completamente la RWN mouse. Un metallico, smussato ago della siringa punta facilita la consegna di un agente, evitando danni alle strutture sottostanti da una punta smusso tagliente. Espellere l'aria all'interno della siringa come bolle possono inavvertitamente riempire il RWN e / o ostacolare la correttaapplicazione dell'agente alla finestra rotonda stessa. Rimuovere la pelliccia dalla pelle post-atriale utilizzando Clippers governare elettrici. Rimuovere pelliccia in una zona che si estende dalla piega atrio-cefalica rostralmente al caudalmente cingolo scapolare. Estendere depilazione dalla dorsale, linea mediana sagittale l'angolo mandibolare laterale. Rimozione pelliccia corretta è fondamentale per il mantenimento di un campo chirurgico pulito e chiaro. Spazzolare delicatamente ritagli dal sito chirurgico. Sterilizzare pelle della zona preparata per protocolli istituzionali. Applicare betadine (povidone / iodio) alternati con etanolo topica in modo circolare per 2 minuti. Altri agenti possono essere sostituite da linee guida istituzionali. Posto l'animale su una superficie piana per mantenere costante posizionamento del corpo durante la procedura. Utilizzare un piccolo rilievo di riscaldamento posto sotto il corpo sulla piattaforma di controllo della temperatura corporea durante la procedura per mantenere la temperatura corporea dell'animale a 36-38 ° C. Non il sobriorheat l'animale in quanto ciò potrebbe causare lievi a seri danni alla pelle e / o all'inizio eutanasia. Fissare la testa dell'animale mediante un apparato di supporto morso / testa. Utilizzare un 0,5 cm di due centimetri morso lavorato da ottone con fori di diametro 2-4 mm forati attraverso di essa ad intervalli di 5 mm lungo l'asse longitudinale. Aprire la bocca dell'animale intorno a questo apparecchio e montare gli incisivi centrali superiori in uno dei fori a seconda delle dimensioni dell'animale. Stringere delicatamente una piccola pinza sopra il dorso della muso dell'animale per tenerlo in posizione (Figura 3). Verificare che il supporto blocchetto / testa morso è rigidamente collegato al centro di un braccio articolato a forma di U (figura 3). Fissare un'asta larga 1 centimetro al braccio sinistro della "U" e utilizzare stelo come una testa di riposo sul lato sinistro (lato destro è sempre il lato operativo). Una volta saldamente nel supporto testa, ruotare il mouse in una posizione di decubito laterale sinistro. Posizionare il corpo carefully sulla superficie piatta di funzionamento per assicurare che possa essere stabile durante tutta la procedura ed evitare lo stress torsionale eccessivo per le vertebre cervicali. Posizionare un microscopio operatorio capace di 4x, 10x e 20x il campo chirurgico. Verificare che il microscopio possa mantenere la sua posizione in modo mani libere come questo è l'ideale per il protocollo chirurgico a due mani discussi di seguito. Posizionare una unità cauterizzazione bipolare-abilitato con parte della mano multa gioielliere a punta in una posizione che è immediatamente disponibile per l'assistenza in cauterizzazione di piccoli vasi e la dissezione dei tessuti. Ciò può anche essere necessario dovrebbe essere rilevato sanguinamento più pesante. 4. approccio chirurgico Sotto ingrandimento microscopico, usare forbici affilate o una lama di bisturi per creare una incisione retroauricolare 1-1,5 cm, di circa 6-8 mm caudale alla piega auriculocephalic. Nel topo adulto, un'incisione dalla linea mediana dorsalelateralmente ad un punto vicino l'angolo della mandibola è adeguata. Evitare accuratamente il taglio in profondità per preservare le strutture vascolari sottostanti. Effettuare un'attenta smussa attraverso lo strato di grasso sottocutaneo che può essere di spessore variabile. Grasso può essere rimosso in sicurezza, se necessario, ad una migliore esposizione. Fare attenzione quando sezionare in una direzione ventrale-mediale come la vena giugulare esterna attraversa questa zona e danni a questa struttura possono provocare grandi quantità di perdita di sangue e allagamento del campo chirurgico. Controllare qualsiasi sanguinamento eccessivo con spugne di gelatina assorbibili e / o pellet di cotone. Utilizzare cauterizzazione bipolare di sanguinamento più pesante. Una volta che lo strato di grasso è correttamente divisa, esporre la muscolatura cervicale. Nota strutture importanti, tra cui il grande corpo muscolare dei cleidomastoideus centrale all'interno del campo chirurgico esposto, la vena giugulare esterna ventrale, e il tessuto parotide rostralmente sovrastante l'angolo della mandibola. Un importante punto di riferimento è un piccolo branc nervih (del nervo craniale XI) che avvolge il margine posteriore / dorsale della cleidomastoideus estendere rostralmente verso la pinna (Figura 4). Estrarre con cautela il corpo cleidomastoideus muscolare in direzione posteriore / dorsale (figure 4, 5). Dividere delicatamente la fascia trasparente che avvolge il corpo muscolare. In modo simile, estrarre con cautela la parotide e vena giugulare esterna in (anteriore / ventrale) direzione opposta (figura 5). Con buona retrazione del corpo cleidomastoideus muscolare, la cupola lucido della bolla timpanica periostio entrerà in vista (Figura 6). Alla parte caudale della bolla, l'inserimento di un muscolo cervicale profonda, la sternomastoideus, sarà visibile (Figura 6). Preservare il nervo facciale, che diventa visibile alla dorsale e aspetti rostrale della cupola bulla. Posizionare un divaricatore di auto-mantenimento (titanio sterile shaft– incorporato in silicone e gettaincollare) prima della perforazione. Con la tecnica a due mani, dividere delicatamente il periostio bulla con diatermia bipolare per esporre l'osso sottostante. Utilizzando pinze o una curette otologica, elevare delicatamente e spingere il periostio in una direzione periferica ampiamente esporre la cupola bulla. Nota: Passo 4.6 è fondamentale per massimizzare la vista chirurgico dello spazio dell'orecchio medio. Utilizzare manipolazione dei tessuti molli meticoloso e delicato per evitare emorragie e / o perdite di liquido interstiziale nella cavità bulla dopo la foratura. C'era una cupola bulla correttamente esposta, praticare un foro pilota 2 millimetri attraverso l'osso bulla con un trapano chirurgico dentale tra il margine caudale della cupola e la linea visibilmente opaca (che rappresenta la membrana timpanica) si estende attraverso l'aspetto rostrale della bolla (Figura 7). Fare attenzione a praticare solo attraverso l'osso per conservare le strutture sottostanti, quali l'arteria stapediale. Praticare un secondo foro pilota vicino per facilitare un-copertura dell'osso bulla (<strong> Figura 7). Utilizzando un paio di pinze punta del gioielliere, stappando l'osso bulla in una dorsale e caudale (Figura 8). Rimuovere l'osso in maniera frammentaria sotto alto ingrandimento. Non forare l'arteria stapediale, che si trova direttamente sotto il tappo bulla, come sanguinamento da questa arteria può compromettere la procedura. Minimizzare la quantità di osso rimosso per prevenire un eccessivo ingresso fluido nell'orecchio medio, pur consentendo ottimale visualizzazione e accesso alla finestra nicchia rotonda (Figura 8). 5. Finestra rotonda Applicazione di ototossiche agente Effettuare sottili regolazioni di rotazione al supporto della testina per portare il RWN esattamente in vista. Il RWN si trova in genere la dorsale e parte caudale dello spazio dell'orecchio medio e appare come un rientro a bicchiere del otico capsula di tessuto osseo. Nella maggior parte dei casi, l'arteria stapediali corre 1-2 mm ventrale / rostrale a questo. Il RWN a volte può essere tucked perifericamente sotto un'angolazione acuta della cupola bulla. In questi casi, un attento posizionamento della testa dell'animale è fondamentale. Utilizzando gli stoppini documento preparato prima dell'intervento, rimuovere tutto il liquido visibile nell'orecchio medio e RWN fino arida viene visualizzata. Nota: Questa è la fase più critica dell'intero protocollo, come ~ 10 microlitri (1 goccia) dell'agente ototoxic applicato al RWN facilmente diluito con questo fluido. Sotto ingrandimento massimo, utilizzare un ago calibro fine su una siringa da tubercolina 1 ml di applicare una goccia (~ 10 ml) di agente ototossica direttamente al RWN, riempiendolo completamente. Fare attenzione a non interrompere l'arteria stapediale e osservare da vicino per la sostituzione di una piccola riflessione della luce alla base di una nicchia a secco con un sordo e nebuloso menisco fluide come un indicatore che la nicchia si sta riempiendo in modo corretto. Lasciare che l'agente di riposare all'interno del RWN per circa 10 minuti il ​​tempo di esposizione. Dopo questo, completamente wick l'agente e sostituirla con una nuova applicazione dello stesso agente. Determinare ripetizioni di applicazione secondo le specifiche degli agenti. Tempo totale di esposizione in questa procedura varia tipicamente da 30 a 60 min. Al termine della procedura, completamente allontanare il dell'agente un'ultima volta e applicare agente fresco al RWN. Lasciare la bulla ridotti e di utilizzare pinze per chiudere il tessuto molle sul sito chirurgico. Sigillare sito chirurgico a livello della cute con un 4-0, non assorbibile sutura monofilamento. Posto l'animale in una gabbia di recupero / stazione. Monitorare condizioni cliniche dell'animale in seguito regolarmente l'operazione. Mantenere l'animale in appropriate condizioni ambientali, inclusi gli alloggi con biancheria da letto morbido e supplementazione con cibi morbidi, per ridurre al minimo lo stress. Determinare le procedure e le condizioni future post-operatorie secondo i protocolli istituzionali IACUC. Utilizzare i protocolli istituzionali IACUC per sterilizzare strumentis prima dell'uso sul prossimo animale. Lasciare per tempo di raffreddamento adeguato tra l'uso dello strumento. 6. Procedure postoperatorie e Cochlear Tissue raccolta Come descritto al punto 2.5, eseguire test fisiologico di udito dopo l'intervento nei punti desiderati e prima del sacrificio. Eseguire le procedure postoperatorie secondo scopi sperimentali. Sacrifica l'animale in qualsiasi giorno postoperatorio desiderato. Su pieno anestesia mediante iniezione IP, come richiesto per i protocolli istituzionali IACUC, sacrifica l'animale. Utilizzando forbici affilate, decapitare animale appena caudalmente all'occipite. Aprire notevolmente la volta cranica con le forbici lungo la dorsale e linea mediana ventrale e diffondere ampiamente. Scavare delicatamente tessuto cerebrale per esporre le ossa temporali. Nota: Un certo numero di procedure per la ricerca di cambiamenti post-esposizione nella coclea può ramificarsi da questo punto e verrà menzionato nella sezione di discussione. Determinare il metodo di indagine più relevant agli scopi sperimentali. Se microscopia elettronica è prevista dopo la coclea sono sezionato, utilizzare cateterizzazione cardiaca per pre-fissare il tessuto. Questo va oltre lo scopo di questa discussione ed è stato coperto in modo approfondito altrove. 13 Tagliare le ossa temporali fuori della base del cranio con le forbici e subito messo in soluzione fissativa. Immergere le ossa direttamente in paraformaldeide al 4% per 1,5 ore a temperatura ambiente. Monitorare il tempo di fissazione, come la maggior durata può limitare l'esito di analisi istologica a passi successivi. Decalcificare sezionato ossa per un periodo di tempo variabile tramite immersione in uno acido etilendiamminotetracetico mm (EDTA).

Representative Results

In un recente studio di Stevens et al utilizzando il protocollo di cui sopra, per adulti topi CBA / caj di entrambi i sessi sono stati esposti attraverso la finestra diffusione turno contro eptanolo. 15 eptanolo un gap giunzione non-accoppiatore noto per la produzione mirata, lesioni recuperabili per le cellule del parete laterale cocleare. Lo scopo dello studio è stato quello di produrre un modello affidabile per danno cocleare mirata, consentendo di investigazione di rigenerazione post-chirurgica di eventuali elementi danneggiati. Soglie uditive pre-chirurgica e post-chirurgiche servito come endpoint funzionale. Microscopia e tecniche di colorazione immunoistochimica sono stati usati per studiare i cambiamenti morfologici. Aumenti significativi soglie ABR sono stati osservati nei topi trattati con eptanolo (Figura 9). Gli animali di controllo trattati con chirurgia simulata, con la consegna di soluzione salina invece di eptanolo, non hanno dimostrato significative variazioni di soglia a qualsiasi frequenza testate. Immunostaining contro un interiormente rettificazionecanale del potassio (Kir) 4.1 servito come un metodo indiretto per la visualizzazione di danni / recupero di strutture cocleari. Ciò ha dimostrato differenze altamente riproducibili tra trattamento e di controllo orecchie. Intensità complessiva colorazione era marcatamente ridotta nel vascularis stria (STV) e tra fibrociti del legamento spirale (SLF) 1-3 giorni dopo l'esposizione eptanolo, che denota una grande quantità di danni diretti a tali aree. C'era un particolare diminuzione dell'intensità Kir 4.1 colorazione nelle aree di tipo II e tipo IV RIFOS (Figura 10) e STV (Figura 11). La prova di integrità nucleare perturbato e cromosomico condensazione / vesciche tipici di apoptosi cellulare è stato anche visto in controcolorazioni nucleari in queste aree cocleari (Figura 10). Vacuolate zone di Kir 4.1 macchiatura risolti nettamente a 7 giorni e erano assenti del tutto a 14 giorni. Quando Kir 4.1 intensità di colorazione è stata quantificata nelle aree di STV, orecchie trattati hanno dimostrato un initial trogolo seguito da uno spostamento significativo (p <0.05) verso intensità controllo 7 giorni dopo l'esposizione eptanolo (Figura 12). Figura 1. Strumento impostato. Rappresentazione della pre-chirurgica set-up di strumentazione. Tutte le attrezzature devono essere facilmente accessibile all'interno del campo chirurgico sterile. Strumentazione tipica comprende 2 forbici affilate dissezione, 2-3 dritto e / o pinze curvo punta del gioielliere con Curettes auricolari, manico curvo scelte otologici (poi sostituito con Rosen prende – non mostrato), e un gruppo elettro-bisturi con una pinza sottile curvo punta del gioielliere copricapo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt = "Figura 2" src = "/ files / ftp_upload / 53131 / 53131fig2.jpg" /> Figura 2. Materiali di consumo chirurgici. Ulteriori forniture per mantenere l'ambiente RWN. Ritagli labwipe sterilizzati per la formazione della carta stoppino (a sinistra), la carta strettamente formata Wicks realizzati con salviette sterilizzati laboratorio (centro), e 4 palline mm cotone (a destra) sono utilizzati per pulire il liquido in eccesso e le inondazioni di sangue nella finestra nicchia rotonda. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3. supporto della testina di animale. Immagine raffigurante il titolare testa e blocca-morso. I fori nel blocco in forma e fissare i incisivi centrali superiori. Un morsetto è leggermente stretto sopra il muso dorsale per fissare l'animale in luogo. L'utilizzo di un supporto testa è fondamentale per il successo outc chirurgicoome. Idealmente, questo dovrebbe essere in grado di ruotare intorno all'asse rostrale-caudale dell'animale per ottimizzare viste chirurgiche della bulla durante la procedura. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 4. Cleidomastoideus m.. Grafico Schema raffigurante l'anatomia di base del roditore muscolatura cervicale e la sua associazione con la vena giugulare esterna. Il muscolo cleidomastoideus è il muscolo più facilmente identificato durante l'approccio chirurgico. Rilascio della fascia avvolgente seguito da retrazione posteriore / dorsale del corpo muscolo dirigerà dissezione chirurgica verso la bolla timpanica (cerchio nero). Cliccate qui per vedere alVersione Arger di questa figura. Figura 5. area di esposizione chirurgica. Rappresenta l'esposizione dopo la dissezione attraverso gli strati di grassi cutanei e sottocutanei. Punti di riferimento strutturale di nota sono un ramo del nervo craniale XI sovrastante il muscolo cleidomastoideus (A), la vena giugulare esterna (B), e il tessuto parotide esposta (C). Il ramo del nervo cranico XI è spesso associata a una piccola nave e deve essere diviso prima di procedere. Destra a sinistra sull'immagine corrisponde all'asse rostrale-caudale dell'animale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 6. Esporre la bulla. L'esposizione della bolla timpanica, dopo un ritorno della cleidomastoideus e strutture circostanti. Punti di riferimento importanti sono il corpo cleidomastoideus muscolare (A) riflette posteriormente / dorsale, il nervo facciale (B), e la cupola lucida del periostio bolla timpanica (C). Inoltre, nota l'inserzione del muscolo sternomastoideus all'aspetto caudale sinistro della bolla timpanica (asterisco). La presenza del nervo facciale alla parte dorsale e rostrale della bolla è un punto di riferimento fondamentale per una vera identificazione del bulla. Destra a sinistra sull'immagine corrisponde all'asse rostrale-caudale dell'animale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 7. Esposizione finestra rotonda nicchia io. Immagine raffigurante il tympanic bulla completamente esposto dopo la dissezione del periostio sovrastante. Il foro pilota è nella posizione migliore a metà strada tra il bordo caudale della cupola bulla e una linea sottile opaca visualizzato all'interno l'aspetto rostrale della bolla (che rappresenta la membrana timpanica). Un secondo foro pilota adiacente può facilitare facile non-copertura dell'osso bulla. Evitare di foratura profonda dovrebbe essere presa in modo da non danneggiare l'arteria stapediale sottostante. L'oggetto metallico scuro in fondo l'immagine è l'arrotolatore tessuto molle in titanio. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 8. Esposizione finestra rotonda nicchia II. Uncapped bolla timpanica con l'esposizione della finestra nicchia circolare (freccia) e l'arteria stapediale (rosso struttura1-2 mm lateralmente alla nicchia) come visto sotto ingrandimento 20x. La nicchia spesso pone in una posizione nascosta sotto l'angolo acuto formato dalla cupola bulla con capsula otica all'aspetto caudale della cupola. È indispensabile che la visualizzazione completa della nicchia avvenire prima dell'applicazione dell'agente ototossici o traspirazione. Rimozione di osso eccessivo durante stappatura dovrebbe anche essere evitata come liquido interstiziale / sangue tendeva ad inondare la cavità in cui sono state create grandi fori. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 9. Risultati rappresentativi -. Eptanolo perdita dell'udito indotta e recupero medio di risposta uditivi del tronco encefalico (ABR) soglie (dB SPL) riportati in funzione del tono pipfrequenza. Le misure sono raggruppati in base alla pre-esposizione (nero-Control) e il giorno post-operatorio (POD) 1, 7, e 14 (rosso). Barre di errore rappresentano SEM. Figura è stato nuovamente tracciata da Stevens et al. 2014. 15 Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 10. Risultati rappresentativi – mirati danno cocleare dopo parte l'esposizione eptanolo I. Variazioni di potassio raddrizzatore interno (Kir) Canale 4.1 colorazione all'interno vascularis stria (STV) delle orecchie trattati con eptanolo e controllare le orecchie. (A) Normale Kir 4.1 colorazione tipica delle orecchie di controllo con forte affinità cella striale per Kir 4.1 (verde). (B) Il trattamento orecchio su Pod1. Ampie zone di vacuolized decrfacilitato Kir 4.1 affinità sono visti all'interno della STV (frecce) con un calo complessivo di STV Kir 4.1 intensità della colorazione. I nuclei sono di contrasto con propidio iodio (rosso) (B). Barra di scala = 15 micron. Figura è stato nuovamente tracciata da Stevens et al, 2014 15 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 11. Rappresentante Risultati – mirati danno cocleare dopo l'esposizione eptanolo parte II Le variazioni del legamento spirale (SL) di eptanolo orecchio trattato rispetto al controllo orecchio.. (A) Normal Kir 4.1 colorazione (verde) nel SL tipica di orecchio di controllo con normale Tipo II appaiono fibrociti legamento spirale (II). (B) eptanolo torecchio reated con marcata diminuzione Kir intensità 4.1 della colorazione nella zona di tipo II fibrociti legamento spirale, interruzione nucleare e cromosomica condensazione / vesciche coerenti con l'apoptosi (Arrows). I nuclei sono di contrasto con propidio iodio (rosso). Barra di scala = 15 micron. Figura è stato nuovamente tracciata da Stevens et al, 2014 15 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 12. Rappresentante Risultati -. Il recupero di intensità di colorazione cocleare in seguito all'esposizione eptanolo significano luminanza relativa di Kir 4.1 colorazione grafico in funzione del giorno post-esposizione. Luminanza relativa è calcolata come Kir 4.1 intensità riflettente sotto microscopio confocale a eptanolo sorpresaorecchie Ed presi come percentuale della stessa nelle orecchie controllo. Nota POD14-28 dati vengono raggruppati come un singolo punto sulla curva. Cerchi pieni rappresentano valori medi, mentre le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. Un significativo recupero di luminanza relativa è stata dimostrata tra il POD 7 e le date successive (del test t di Student p <0.05, asterisco). Figura è stato nuovamente tracciata da Stevens et al., 2014. 15 Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

I risultati di protocollo e di rappresentanza di cui sopra sono stati ottenuti in un modello CBA / caj topo tra cui entrambi i sessi. Questo ceppo inbred è ben definito come standard "buon udito" e il modello "normale invecchiamento" nel sentire ricerca. 16-23 Descrizione di uso di questo protocollo in altri modelli di mammiferi va oltre lo scopo di questo testo. Il lettore dovrebbe notare, tuttavia, che la tecnica di applicazione RWN offre diversi vantaggi per studiare l'orecchio interno mammiferi. Di questi, il più notevole è che evita interruzioni diretta della struttura anatomica delicata e gradienti biochimici che esistono all'interno delle mura della capsula otica. Procedure come cocleostomia e l'impianto di pompe di infusione hanno la propensione a violare direttamente strutture dell'orecchio interno che portano a cambiamenti di soglia permanenti; un fatto che deve essere preso in considerazione quando si analizzano i risultati. Turbativa di strutture murarie laterali cocleari da metho invasivads può anche limitare l'uso di agenti ototossici quali furosemide o eptanolo, la cui specifica zona di effetto è limitata a quella posizione. 15,24 alternativi approcci non invasivi come l'iniezione trans-timpanica e iniezione parenterale sono stata colpita da risultati inaffidabili e / o tossicità sistemica al modello animale. Questo metodo di applicazione ha dimostrato di evitare sia di queste carenze, raggiungere un livello di consistenza si avvicina a quella dei metodi più invasivi discussi sopra.

Altri vantaggi di questa tecnica sono è la sua ampia applicabilità ad una serie di modelli animali e della fattibilità di incorporare in un'infrastruttura di laboratorio esistente. Per quanto riguarda quest'ultimo, senza reagenti specializzati o prodotti chimici sono tenuti a parte le scelte ototossiche agenti, anestetici e analgesici. Agenti ototossici sono tipicamente utilizzati ad una concentrazione fissa e mescolati in un grande volume sufficiente di soluzione di (5 ml) per durare lunghi periodi di tempo in considerazioneing ogni applicazione utilizza circa 10 ml (nei topi). Così, dopo l'acquisto iniziale di forniture e di strumenti, gli investigatori sono relativamente liberi da tempo di preparazione soluzione o frequente sostituzione dei materiali. Questa tecnica offre anche riduzioni di tempo operatorio, che possono essere significativi rispetto alle procedure che coinvolgono l'impianto di pompe di infusione perilinfatici o cochleostomies. Dopo aver raggiunto un livello di competenza tecnica, il nostro tempo medio di completamento dall'incisione iniziale alla chiusura era tipicamente 20 min a 1,5 ore a seconda della lunghezza di esposizione desiderata per l'agente ototossici. Tre o quattro interventi chirurgici possono essere espletate con facilità in un solo giorno, consentendo una maggiore efficienza e una maggiore possibilità di ottenere risultati di successo. Come descritto sopra, questa tecnica può essere facilmente applicata ad una varietà di modelli di roditori cui topi, ratti, cavie e gerbilli.

Limitazioni di questo metodo sono centrati sullamoderatamente ripido curva di apprendimento necessaria per dominarlo e diminuito risultati attesi fino a raggiungere competenza tecnica. Come verrà discusso più dettagliatamente in seguito, piccoli errori durante l'approccio chirurgico o visualizzazione insufficiente del campo chirurgico saranno quasi invariabilmente portare ad un risultato povero. Risultati sottili che un novizio può riuscire a riconoscere, come un sub-millimetro di spessore bolle d'aria bloccando l'accesso dell'agente alla membrana della finestra rotonda o liquido interstiziale diluire l'agente, prendere tempo per apprezzare e sviluppare le competenze psicomotorie necessarie per correggerli. Tuttavia, con la prestazione ripetuta la procedura di questi ostacoli sono facilmente superabili e costituiscono una sfida tecnica meno scoraggiante per gli investigatori che alcuni dei metodi invasivi di cui sopra. Infine, questa tecnica è associata con la limitazione relativa che il pregiudizio cocleare può essere indotta solo in un singolo punto nel tempo durante l'esposizione chirurgica. Questo può essere superato in una certa misura, Riempiendo il RWN con assorbibile spugna di gelatina imbevuto l'agente come è stato descritto da Heydt et al. 10 La spugna di gelatina assorbibile sarà resorb nel tempo, ma può consentire un periodo di esposizione più lungo è ottenibile attraverso l'applicazione di una soluzione acquosa da solo.

Affinché un ricercatore di realizzare tutti i vantaggi di questa tecnica ed evitare eventuali insidie, è fondamentale riconoscere i due elementi critici di questa tecnica: 1) mantenere costantemente la visualizzazione dello spazio dell'orecchio medio e RWN; e 2) la capacità di mantenere campo operatorio privo di liquido interstiziale e / o di sangue. Nel realizzare il primo di questi, l'importanza di una testa porta-corretto non può essere troppo enfatizzata. Fissaggio sicuro della testa dell'animale assicura una vista stabile al microscopio; la cui importanza diventa facilmente evidente quando strumentazione sottile cambia drasticamente il posizionamento delle strutture sotto ingrandimento. Un buon htitolare ead che può ruotare attorno all'asse rostrale-caudale dell'animale facilita anche importanti cambiamenti dinamici nella linea del ricercatore del sito. Spesso, pochi millimetri di rotazione intorno a questo asse può significare la differenza tra la visualizzazione del RWN e visualizzazione della sola capsula otica osso. La capacità di cambiare costantemente punto di vista è anche fondamentale per garantire liquido interstiziale viene correttamente rimosso dalle profondità della nicchia e anche che l'agente ototossici è completamente rimosso tra le applicazioni, come discusso nella parte 5. Secondo la nostra esperienza, il sangue, la condensazione, o liquido interstiziale che entra nello spazio dell'orecchio medio ha la capacità di interferire con intero esperimento. Ciò non è sorprendente, come la piccola quantità di agente ototoxic applicata alla finestra rotonda (~ 10 microlitri) può essere facilmente diluito entrando in contatto con anche piccole quantità di liquidi estranei. Per questo motivo, dissezione chirurgica meticolosa, stappatura frammentario della bolla timpanica e attenta corrion dell'arteria stapediale sono equivale a un successo i risultati sperimentali.

Se si osservano le fasi critiche di cui sopra ed i risultati attesi non sono ancora raggiunti, la risoluzione dei problemi deve iniziare. Nella nostra esperienza, è spesso utile per effettuare variazioni di prova di due elementi procedurali. Il primo è quello di modificare la frequenza con cui l'agente ototossica viene rifornito nella finestra rotonda. Seconda dell'agente utilizzato, tempo di esposizione totale è compresa tra 30 min e 1 ora, con assorbimento completo e successiva sostituzione dell'agente ogni 10 min. Se esponendo per durate più brevi, aumentando l'esposizione complessiva può consentire all'agente più tempo per diffondere attraverso la membrana della finestra rotonda. Esposizione aggiuntiva e reintegro possono anche aiutare a evitare la diluizione indesiderati dell'agente ototossici di sangue, condensazione, o interstiziale come discusso in precedenza. L'attenzione dovrebbe essere mantenuta quando si utilizza questo approccio, tuttavia, in quanto tende ad aumentare il rischio di accidentalely ferendo l'arteria stapediale e / o l'introduzione di liquido interstiziale al RWN.

Questa tecnica è significativo in ciò che offre alle indagini di fisiologia cocleare e fisiopatologia. Questa tecnica minimamente invasiva consente studio dettagliato dei processi biochimici delicati ed è stato equivalente a promuovere la nostra ricerca volta a valutare cocleare potenziale rigenerativo. 12,24 Tale approccio chirurgico e l'esposizione è anche riprodotto attraverso una varietà di altre tecniche propaggine, e risultati positivi con questo metodo sono stati riportati in studi di impianto cocleare cellule staminali. 14 Molto rimane sconosciuto circa la coclea, però, questa tecnica, insieme con il più ampio armamentario a disposizione di ricercatori, sarà di aiuto nel ridurre tale gap di conoscenza.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by National Institutes of Health (NIH) Grant number: NIH P50DC00422 (H.L.); NIH R01DC12058 (H.L.). This work also benefitted from the South Carolina Clinical and Translational Research Institution (SCTR) Clinical and Translational Science Award (NIH/NCRR UL1RR029882). The funders had no role in study design, data collection, and/or analysis. The authors would like to thank Lonnie E. Brown Jr. for his artistic and graphic contributions.

Materials


 

1-Heptanol 98% Sigma-Aldrich H2805  PubChem Substance ID 24895536
250ML
Ketaset Injectable  Patterson Veterinary 07-803-6637  Concentrate 100mg/ml
(Ketamine HCl) 10ml Schedule CIII controlled substance
Anased Injectable Lloyd Laboratories NADA# 139-236 Concentrate 20mg/ml
(Xylazine)
Buprenex Injectable  Patterson Veterinary 07-850-2280  Concentrate 0.3mg/ml
(Buprenorphine HCl) 5 ampules per box Schedule CIII controlled substance
Betadine Skin Prep Solution Medline MDS093941  1 Quart screw top bottle
(Povidone-Iodine)
0.9% Sterile Saline Variable N/A For mixing solutions and injections
Table of Equipment, Surgical Instruments, and Specific Techniques
Material Name Company Catalogue Number Comments (optional)
Operating Microscope Carl Zeiss 32192
Controlled Acoustics Environment Sound Booth Industrial Acoustics Company N/A
Surgical Head Holder Custom Made –  Please see Figure 3
Medical University of South Carolina
Neck Soft-Tissue Retractor (Wire Speculum, Titanium) 1.75inch World Precision Instruments 555801L Maximum spread 20mm
Embedded in disposable putty to affix dynamically to head holder
90N Dental Belt Driven Hand Drill  Emesco N/A (Vintage Item)
Scalpel Handle Size6 Bard-Parker MEDC-011990
#15c Stainless Steel Surgical Scalpel Blade  Bard-Parker SKU: 097-7215 50 Blades/Box
Via ACE Surgical Supply Code
Straight Tip Jewelers Forceps  Bernell MIL17304
Iris Scissors Curved Medline DYND04026 
Iris Scissors Straight Medline DYND04025 
Stevens Tenotomy Scissors Straight Medline MDG3222111 
Rosen Ear Needle Straight Shaft, Lightly Curved Tip MytaMed Item# 6.56.00 Figure 1 demonstrates angled shaft picks. This was later substituted for the Rosen picks
Rosen Ear Needle Straight Shaft, Strongly Curved Tip MytaMed Item# 6.56.01
Kimwipes Delicate Task Wipers  Kimtech Science CODE 34155  White, Size 4.4×8.4 Inch. Cut to triangles and rolled into fine tip wicks.
House Ear Curette, 6” shaft, light angle Medline MDG0396486 
Gelfoam (absorbable gelatin sponge) Size 100 Medline IIS34201  Substitutions may be made
Cotton pellets #3 4mm Richmond Manufacturer Code 100108
ElectroSurgical Unit 100 E M/M Elmed List No. 52-5770 Bipolar and Monopolar Capable
1cc U-100 Insulin Syringe 28G, 0.5” length needle BD Product Number: 329410 Optional for delivery of Ototoxic agent
23G, blunt tip, 1” length needle Kendall Product Code 8881202397 For controlled delivery of Ototoxic agent with less risk of damaging stapedial artery
Surgical Mask U-line S-10478
Exam Grade Nitrile Surgical Gloves U-line S-12549
Precision Hair Clippers Wahl N/A Multiple models may be substituted
5-0 Nylon black monofilament suture on PC-1 13mm 3/8 circle needle Ethilon 1855G Substitutions may be made. 
Instant Sealing Sterilization Pouch Fisher 01-812054
Dry Sterilizer ROBOZ Germinator TM 500
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References

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Stevens, S. M., Brown, L. N., Ezell, P. C., Lang, H. The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration. J. Vis. Exp. (105), e53131, doi:10.3791/53131 (2015).
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