Die Maus Round-Fenster-Ansatz für Ototoxische Agent-Lieferung: eine schnelle und zuverlässige Technik zur Induktion Cochlear Zelldegeneration

Alle Aspekte der Forschung an Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der entsprechenden Institutional Animal Care und Verwenden Committee durchgeführt. Alle hier beschriebenen Wirbeltierversuchsverfahren wurden unter den Richtlinien der Medizinischen Universität von South Carolina (MUSC) Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) zugelassen. 1. Modellauswahl Pflegen Sie das Tiermodell in einem rauscharmen Vivarium mit Routine-Hauswartung per institutionellen Protokolle bis zur Verwendung. In Tierforschungseinrichtungen (ARFs), pflegen Vibrationsfestigkeit, Geräuschdämpfung, tägliche Beleuchtung, prep Raum, Oberflächen, Abdichtung und Abdichten, und Lüftung, die NIH-Standards zu erfüllen. Hinweis: National Institutes of Health (NIH) Leitlinien für ARFs und Wartung eines rauscharmen Vivarium kann überprüft werden: http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/ Für alle Versuche, verwenden Sie das rechte Ohr wie die experimentelle Ohr. Das linke Ohr dient als intra-Tier-Steuerung und nicht chirurgisch verändert. Überprüfen Sie die Modelltier vor der Operation auf Anzeichen von mittleren oder äußeren Ohr-Infektion. Potential Zeichen können Flüssigkeitsabsonderung oder Eiter aus dem Ohr, entzündete Gewebe Ohrmuschel und / oder Trägheit des Tieres enthalten. Das ist ungewöhnlich, aber wenn darauf hingewiesen, zu vermeiden, eine weitere Operation und Behandlung der tierischen angemessen. 2. Präoperative Prozeduren Betäuben das Tier 30 Minuten vor dem chirurgischen Eingriff und alle perioperative Verfahren via intraperitoneale (IP) Injektion von Ketamin (100 mg / kg IP) und Xylazin (20 mg / kg IP). Ergänzen Anästhesie erforderlich, wie durch eine positive Vorspur pinch Reflex beurteilt, mit einer niedrigeren Dosis von Ketamin (25 mg / kg IP) und Xylazin (5 mg / kg IP). Bestimmen Sie die Dosierung in Übereinstimmung mit den institutionell zulässige Protokolle für Mäuse mit dem Alter entsprechende Anpassungen der Dosis. Überprüfen Sie für weitere sedation des Modells. Überprüfen Sie für eine Bühne 3 Ebene der Anästhesie für die Gesamtheit der durch eine regelmäßige Atmung, fehlende Gewichtsreflexes (bei Mäusen), und der Mangel an Pedal und der Augenlid (toe-Pinch) Reflexe markiert beschriebenen Protokoll. Pflegen Sie das Tier auf dieser Ebene der Anästhesie. Dies ist von größter Bedeutung für die Minimierung von Schmerzen und intraoperative Bewegung, Blutungen und Auslaufen von interstitiellen Flüssigkeiten während der Operation. Aufrechterhaltung der Körpertemperatur des Tieres bei 37,5 ° C mit einer geschlossenen Schleife Heizkissen. Verwalten Analgesie subkutane Injektion von Buprenorphin. Geben Buprenorphin (0,1 mg / kg SQ einmal 30 Minuten vor der Operation), wie Analgesie, jede chirurgische Beschwerden zu minimieren. Basis Dosierung und Alternativen geeignet, um das ausgewählte Modell auf institutionell genehmigten Protokolle. Antibiotika nicht notwendig ist, wenn gute aseptischen Bedingungen durchgeführt worden ist. Die Tiere erhalten die postoperative Analgesie, wenn Anzeichen von Schmerzen und Leiden. Führen physiologic Tests präoperativ. Darstellende akustisch evozierte Hirnstamm (ABR) Prüfung und / oder Verzerrungsprodukt optoakustischen Abgasuntersuchung (DPOAE) sowohl präoperativ und kurz vor der Tieropfer dient als objektives Maß für die Wirkung des gewählten ototoxischen Agent auf der Maus die Anhörung. 3. Chirurgische Vorbereitung und Positionierung Sterilisieren Sie alle Instrumente präoperativ pro institutionellen Standards. Bereiten chirurgischen Instrumenten und Feld in einem konsistenten, steril, und organisierten Art und Weise, um nicht benötigte Anstrengung und Bewegung während des Verfahrens zu verhindern. Typische Instrumente erforderlich, beinhaltet scharfe Präparierschere, mehrere Paare von metallischen Pinzette mit Juwelier-Tipps, ein otologischer Pick ein otologischer Löffel und eine bipolare Elektrokauter Einheit (Abbildung 1). Vorzubereiten und zu sterilisieren Papier Dochte aus labwipes im Voraus gemacht, indem ein kleines dreieckiges Stück des wischen (~ 0.7 in x 1,25 in x 1.75) und Verdrehen sie fest zwischen Daumen und Zeigefinger einer Hand (~ 1,25). Schaffung eines eng verdrillte, extrem dünne Docht ist von größter Bedeutung für den Erfolg des Verfahrens. Bereiten Sie insgesamt 15-20 Dochte vor der Operation (Abbildung 2). Verwenden Sie einen Dentalbohrer, um schnell zu perforieren den Knochen der Bulla tympanica kontrolliert. Verwendung eines riemengetriebenen zahnärztlichen Handbohrmaschine mit 1 oder 2 mm verjüngte Spitze bevorzugt. Der Einsatz des Mikroskops ist notwendig, um das Protokoll zu beenden. (siehe Schritt 4.7) Vorverlosung 0,2 ml einer wässrigen Lösung, die das ausgewählte ototoxic Mittels in einer 1 ml Tuberkulin-Spritze mit einer 28 G, 1/2 'Nadel. Typischerweise 1 Tropfen (~ 10 & mgr; l) des Mittels ausreicht, um die Maus RWN vollständig ausfüllen. Ein metallisches, erleichtert die stumpfe Spitze Spritzennadel die Abgabe des Mittels und verhindert Schäden an darunter liegenden Strukturen durch eine scharfe Kegelspitze. Zu vertreiben keine Luft in der Spritze als Blasen versehentlich füllen das RWN und / oder die adäquateAnwendung des Mittels an das runde Fenster selbst. Entfernen Fell von der Post-Ohrenhaut mit elektrischen Grooming Clippers. Entfernen Fell in einer Zone, die sich von der auriculo-Kopffalte rostral mit dem Schultergürtel kaudal. Verlängern Sie die Haarentfernung von der dorsalen, sagittalen Mittellinie an den Kieferwinkel seitlich. Sicheres Entfernen Fell ist von größter Bedeutung für die Erhaltung einer sauberen und klaren Operationsfeld. Bürsten Sie Ausschnitte aus der vorgesehenen Operationsstelle. Sterilisieren Sie die Haut von vorbereiteten Fläche pro institutionellen Protokolle. Gelten Betadin (Povidon / Iod) mit Ethanol topisch kreisförmig 2 min gewechselt. Andere Mittel können pro institutionellen Richtlinien ersetzt werden. Legen Sie das Tier auf eine ebene Fläche, um konstante Körperhaltung während des Verfahrens aufrecht zu erhalten. Mit einem kleinen Heizkissen unter dem Körper platziert auf die Plattform, um die Körpertemperatur während des Verfahrens zu steuern, um die Körpertemperatur des Tieres auf 36-38 ° C zu halten. Ove nichtrheat das Tier da dies zu leichten bis schweren Hautschäden und / oder frühen Euthanasie führen. Befestigen Sie den Kopf des Tieres über eine Aufbiss / Kopfhaltevorrichtung. Nutzen ein 0,5 cm 2 cm Aufbiss aus Messing gefräst mit 2-4 mm Durchmesser Löchern durch sie jeweils 5 mm entlang der langen Achse gebohrt. Öffnen Sie das Maul des Tieres um diese Halterung und setzen Sie die oberen mittleren Schneidezähne in eine der Bohrungen je nach Größe des Tieres. Eine kleine Klammer über dem Rücken der Schnauze des Tieres, um es in Position zu halten (Abbildung 3) leicht anziehen. Bestätigen Sie, dass der Aufbiss / Kopfhalter fest mit der Mitte eines U-förmigen Gelenkarm (Abbildung 3) verbunden ist. Sichern Sie sich einen 1 cm breiten Stange in den linken Arm des "U" und benutzen Stange als linksseitigen Kopfstütze (auf der rechten Seite ist immer die operative Seite). Einmal fest in der Kopfhalter befestigt ist, drehen Sie die Maus auf einer linken Seitenlage. Positionieren Sie den Körper carefully auf der flachen Arbeitsfläche, um sicherzustellen, es wird während des gesamten Verfahrens stabil sein und vermeiden unnötige Torsionsspannung an der Halswirbel. Positionieren Sie ein Operationsmikroskop in der Lage, 4x, 10x und 20x Vergrößerung auf das OP-Feld. Zu bestätigen, dass das Mikroskop kann seine Position in einer freihändigen Weise aufrechtzuerhalten, wie dies ideal für die zweihändige chirurgische Protokoll unten diskutiert. Legen Sie eine bipolare-fähigen Kauter Einheit mit Handstück feiner Spitze Juwelier in der Lage, die für die Unterstützung bei der Ätzung von kleinen Gefäßen und Dissektion von Gewebe sofort zur Verfügung steht. Dies kann auch erforderlich sind, sollten starke Blutungen auftreten können. 4. Chirurgische Ansatz Unter mikroskopischer Vergrößerung, verwenden Sie eine scharfe Schere oder ein Skalpell, um einen 1-1,5 cm postaurikulären Schnitt etwa 6-8 mm kaudal der auriculocephalic Falte erstellen. In der erwachsenen Maus, ein Einschnitt von der dorsalen Mittellinieseitlich bis zu einem Punkt in der Nähe des Kieferwinkels ausreichend. Sorgfältig vermeiden, schneiden tief darunter liegenden Gefäßstrukturen zu bewahren. Führen Sie vorsichtig stumpf durch die subkutanen Fettschicht, die mit variabler Dicke sein kann. Fett kann, falls notwendig, um eine verbesserte Belichtungs sicher entfernt werden. Seien Sie vorsichtig beim Sezieren in einer ventralen-medialen Richtung wie die äußere Halsschlagader durchläuft diesen Bereich und Schäden an dieser Struktur kann große Mengen an Blutverlust und Überflutung des Operationsfeld führen. Kontrolle jeder starke Blutungen mit resorbierbaren Gelatineschwämme und / oder Wattepellets. Verwenden bipolaren Kauter für schwerere Blutungen. Sobald die Fettschicht richtig aufgeteilt ist, setzen die Halsmuskulatur. Hinweis wichtigen Strukturen einschließlich der großen Muskelkörper der cleidomastoideus zentral innerhalb des freiliegenden chirurgischen Bereich, der externen Jugularvene ventral, und Ohrspeicheldrüsengewebe rostral über dem Winkel der Unterkiefer. Ein wichtiger Meilenstein ist ein kleines Nerven branch (der Hirnnerv XI), die um den hinteren / dorsalen Rand des cleidomastoideus wickelt den rostral zu der Ohrmuschel (Abbildung 4) zu verlängern. In einer hinteren / dorsal zurückzuziehen vorsichtig die cleidomastoideus Muskelkörper (4, 5). Teilen Sie vorsichtig den transparenten Faszie umhüllt den Muskel Körper. Auf ähnliche Weise sanft Einfahren der Parotis und äußere Jugularvene in die entgegengesetzte (anterior / ventral) Richtung (Figur 5). Mit guten Einfahren des cleidomastoideus Muskelkörper, wird der glänzende Kuppel der Bulla tympanica Knochenhaut in den Blick (Abbildung 6) zu kommen. Am kaudalen Aspekt der Bulla, das Einfügen eines tieferen zervikaler Muskel, der sternomastoideus, in Sicht (Abbildung 6) zu kommen. Erhaltung der Gesichtsnerven, die an der dorsalen und rostralen Aspekt der Bulla Kuppel sichtbar wird. Legen Sie ein Selbsthalter (Sterile Titan shaft– in Einweg-Silikon eingebetteteinfügen) vor dem Bohren. Mit Zwei-Hand-Technik, sanft unterteilen die Bulla Knochenhaut mit bipolarer Diathermie, um die darunter liegenden Knochen freizulegen. Mit einer Pinzette oder eines otologischer Löffel vorsichtig heben und schieben Sie die Knochenhaut in einer Umfangsrichtung zu stark setzen die Bulla Kuppel. Beachten: Schritt 4.6 ist für chirurgische Ansicht des Mittelohrraum zu maximieren. Nutzen Sie sorgfältige und schonende Umgang mit den Weichteilblutungen und / oder Auslaufen von interstitieller Flüssigkeit in die Bulla Hohlraum nach dem Bohren zu vermeiden. Bei einer richtig belichtet Bulla Kuppel, bohren Sie ein 2 mm Pilotbohrung durch die Bulla Knochen mit einer zahnärztlichen chirurgischen Bohrer zwischen dem kaudalen Rand der Kuppel und der sichtlich undurchsichtigen Linie (die das Trommelfell), die sich über den rostralen Aspekt der Bulla (Abbildung 7). Achten Sie darauf, nur durch Knochen zu bohren, um zugrunde liegenden Strukturen, wie beispielsweise die Arteria stapedia bewahren. Bohren Sie ein zweites Pilotbohrung in der Nähe, um un-Überdachung des Bulla Knochen zu erleichtern (<strong> Abbildung 7). Mit einem Paar Spitze Pinzette Juwelier, uncap die Bulla Knochen in einem Rücken- und Schwanzrichtung (Abbildung 8). Entfernen Sie die Knochen in einer stückweise unter hoher Vergrößerung. Punktion nicht die Steigbügel Arterie, die direkt unterhalb der Bulla Cap liegt, wie Blutungen aus dieser Arterie kann das Verfahren beeinträchtigen. Minimieren Sie die Menge der Knochen entfernt, um übermäßige Flüssigkeitseintritt in das Mittelohr zu verhindern trotzdem erlauben hervorragende Visualisierung und den Zugang zu der runden Fensternische (Abbildung 8). 5. Runde Fenster Anwendung Ototoxische Agenten Machen subtile Dreh Anpassungen an dem Kopfhalter, um die RWN quadratisch in den Blick zu bringen. Das RWN wird typischerweise auf den dorsalen und kaudalen Seite der Mittelohrraum angeordnet und erscheint als topfartigen Einzug der Ohrkapsel Knochen. In den meisten Fällen verläuft die Arteria stapedia 1-2 mm ventral / rostral zu diesem. Das RWN kann manchmal tuc seinperipher in einem spitzen Winkelung der Bulla Kuppel ked. In solchen Fällen ist eine sorgfältige Positionierung der Kopf des Tieres von größter Bedeutung. Mit Hilfe der Papier Dochte präoperativ vorbereitet, entfernen Sie alle sichtbaren Flüssigkeit im Mittelohr und RWN bis trocken Knochen wird visualisiert. Anmerkung: Dies ist der wichtigste Schritt des gesamten Protokolls als die ~ 10 & mgr; l (1 Tropfen) ototoxischer Mittels zum RWN aufgebracht leicht durch diese Flüssigkeit verdünnt werden. Unter maximaler Vergrößerung, verwenden Sie eine feine Kaliber Nadel auf einem 1 ml Tuberkulinspritze zu einem Tropfen (~ 10 & mgr; l) von ototoxischen Mittel direkt an die RWN gelten, vollständig zu füllen. Achten Sie darauf, nicht stören die Steigbügel Arterie und genau zu beobachten, für den Ersatz von einer kleinen Lichtreflexion an der Basis eines trockenen Nische mit einer matt und trübe Flüssigkeitsmeniskus als Indikator, dass die Nische richtig Füllung. Lassen Sie das Mittel, um innerhalb der RWN für ca. 10 min Belichtungszeit ausruhen. Danach vollständig wick die Mittel und ersetzen sie durch eine neue Anwendung des gleichen Anbieters. Bestimmen Sie Wiederholungen der Anwendung gemäß Mittel-Spezifikationen. Gesamtbelichtungszeit bei dieser Vorgehensweise liegt typischerweise im Bereich zwischen 30 bis 60 min. Am Ende des Verfahrens vollständig abzusaugen den Agenten ein letztes Mal und gelten frische Mittels auf die RWN. Lassen Sie das Bulla uncapped und benutzen Pinzette, um das Weichgewebe über der Operationsstelle zu schließen. Abdichten Operationsstelle auf der Ebene der Haut mit einem 4-0, nicht resorbierbare Monofilament-Nahtmateriales. Legen Sie das Tier in einem Erholungskäfig / Bahnhof. Überwachen klinischen Zustand des Tieres regelmäßig nach der Operation. Pflegen Sie das Tier in geeigneten Umgebungsbedingungen, einschließlich Wohnraum mit weichen Betten und Supplementierung mit weiche Nahrung, um Stress zu minimieren. Bestimmen Sie, zukünftige Verfahren und postoperative Zustände nach den institutionellen IACUC Protokolle. Verwenden institutionellen IACUC Protokolle Instrument zu sterilisierens vor der Anwendung auf das nächste Tier. Lassen Sie für eine ausreichende Kühlung Zeit zwischen Instrument Gebrauch. 6. Postoperative Verfahren und Cochlear Tissue Harvesting Wie in Schritt 2.5 beschrieben, durchführen physiologische Prüfung des Gehörs postoperativ an gewünschten Punkten und vor der Tötung. Zuführen Postoperative Verfahren nach experimentelle Zwecke. Opfern das Tier auf jeden gewünschten postoperativen Tag. Bei Vollnarkose über IP-Injektion, nach institutionellen IACUC Protokolle erforderlich ist, zu opfern das Tier. Mit Hilfe einer scharfen Schere, enthaupten Tier nur kaudal des Hinterhauptbein. Stark öffnen Sie das Schädeldach mit einer Schere entlang der dorsalen und ventralen Mittellinie und weit verbreitet. Vorsichtig aushöhlen Hirngewebe, die zeitlichen Knochen freizulegen. Hinweis: Eine Reihe von Verfahren für die Untersuchung nach der Exposition Veränderungen in der Cochlea können von diesem Punkt verzweigt und werden in der Diskussion Abschnitt erwähnt werden. Bestimmen Sie die Untersuchungsmethode meisten relevant an die experimentellen Zwecke. Wenn Elektronenmikroskopie ist geplant, nachdem der Cochlea geschnitten werden, verwenden Sie Herzkatheteruntersuchung vor, eine Fixierung des Gewebes. Dies würde den Rahmen dieser Diskussion und hat sich in der Tiefe an anderer Stelle abgedeckt. 13 Schneiden Sie die Schläfenbeine aus der Schädelbasis mit der Schere und sofort in Fixierungslösung gelegt. Tauchen Knochen direkt in 4% Paraformaldehyd 1,5 h bei RT. Überwachen Fixierungszeit, wie längere Dauer kann das Ergebnis der histologischen Analyse bei späteren Schritten zu begrenzen. Entkalken seziert Knochen für eine variable Zeitperiode durch Eintauchen in 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA).