JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
免疫与感染

Раннее проникновение вируса Анализы для идентификации и оценки антивирусных соединений

Published: October 29, 2015
doi:
10.3791/53124
, , , ,
1Department of Chinese Medicine,Taipei Medical University Hospital, 2Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, College of Medicine,Taipei Medical University, 3Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, College of Medicine,Taipei Medical University, 4Division of Hematology and Oncology, Department of Internal Medicine,Taipei Medical University Hospital, 5Department of Internal Medicine, School of Medicine, College of Medicine,Taipei Medical University, 6Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicine,Taipei Medical University

Summary

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Abstract

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Introduction

Viral infections are a constant threat to the public health and a significant cause of epidemic diseases, morbidity, and deaths worldwide. Specific modes of control against viral infections include vaccine development and antiviral therapies. While vaccine efforts have proven successful in immunizing against several viruses, many viral pathogens remain without a protective vaccine including dengue virus (DENV), human cytomegalovirus (HCMV), hepatitis C virus (HCV), human immunodeficiency virus (HIV), and respiratory syncytial virus (RSV)1-5. Antivirals, on the other hand, play an important role for the management of these viral infections when prophylactic vaccines are unavailable. However, to date, only few licensed and cost-effective antiviral drugs are available compared to the number of viral pathogens that threatens the public health. More importantly, due to an increase in global travel and rapid urbanization, the situation is aggravated by risks of epidemic outbreaks from emerging/re-emerging viral infections that are being introduced into non-indigenous areas6. Recent outbreaks caused by severe acute respiratory syndrome (SARS) virus, influenza viruses (H1N1, H5N1, H3N2, and H7N9), DENV, West Nile virus (WNV), measles virus (MV), Middle East Respiratory Syndrome (MERS) virus, and Ebola virus6-12 are among the examples reflecting the need for antivirals development when immunization and/or therapeutics are unavailable. In addition, there is always a potential risk of generating drug-resistant infections with currently used antivirals. Thus, the continuous development and expansion of the scope of antivirals to these emerging/re-emerging viral infections are necessary to provide better management strategies and safeguard the public health.

Most antiviral therapies consist of direct acting antivirals (DAAs) which target a specific viral protein or cofactor that mediates important steps in the viral life cycle. For example, the nucleoside analogue Acyclovir inhibits herpesvirus DNA polymerase, protease inhibitors Boceprevir and Telaprevir antagonize the HCV NS3, and Oseltamivir and Zanamivir are neuraminidase inhibitors that block the release of influenza virus particles from infected cells13-15. There are however very few licensed viral entry inhibitors including Enfuvirtide, which targets HIV gp41 to prevent fusion, and Maraviroc, which blocks the HIV co-receptor CCR5, thereby preventing viral entry16. Exploring novel antagonists/inhibitors to viral entry could help provide additional therapeutics for prophylactic or therapeutic use, such as in combination with other antivirals with a different mechanism of action to better manage viral infections17-19.

Identification of antivirals can involve structure-guided drug design and candidate drug screening-based strategy. Methods for assessing antiviral activity of test agents include biochemical assays of enzymatic activity and evaluation by cell-based systems20-23. In cell-based systems, the viral life cycle can be dissected into distinct stages of infection, such as entry events (attachment, fusion, uncoating), the replication phase (viral genome replication and protein translation), and virion egress (assembly, maturation, and release). Since the assays can be adapted to investigate each specific stage using various tools and methods, this approach allows identification/examination of potential candidate antivirals with a specific mechanism of action targeting the distinct stage analyzed. For instance, to analyze drug effect specifically on the free virus particles prior to binding to the host cell, a ‘viral inactivation assay’ can be performed. In this assay, the virus is allowed to incubate with the test drug and then diluted to titrate out the drug before infecting a cell monolayer. Additional steps such as viral attachment and entry/fusion stages can also be analyzed individually, by shifting the temperature during the infection. For many enveloped viruses, viral entry/fusion at the host cell membrane is greatly facilitated at 37 °C, but is typically precluded at 4 °C which does not affect virus binding24-29. Finally, the use of reporter viruses or cell systems could facilitate these studies and permit a high-throughput analysis.

We previously employed the cell-based approach and dissected the early entry of various enveloped viruses for the examination of antiviral compounds that potentially antagonize viral entry30,31. Herein, the various methods used, including viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion assays, are described.

Protocol

Примечание: Убедитесь, что все процедуры, связанные с культурой клеток и вирусную инфекцию проводятся в сертифицированных биобезопасности капюшонами, которые подходят для уровня биобезопасности образцов обрабатывается. Для целей описания протоколов, Gaussia репортера люциферазы с метками ВГС используется в качестве модели вируса 32. В контексте представительных результатов, соединения chebulagic кислоты (CHLA) и punicalagin (МОПС) используются в качестве кандидатов противовирусных, которые нацелены на вирусные гликопротеин взаимодействие с клеточной поверхности гликозаминогликанов в течение раннего вирусного входа шаги 31. Гепарин, который, как известно мешать ввода многих вирусов 30,31,33,34, используется в качестве положительного контроля лечения в таком контексте. Для основного фона по методам вирусологических, распространения вирусов, определения титра вируса, и выражение инфекционной дозы в бляшкообразующих единиц (БОЕ), сосредоточиться единиц (БОЕ) или множественность заражения (МВД), читатель вновьпривилегированных ссылаться 35. Для предыдущих примерах и оптимальных условиях, используемых для вирусов, показанных в представительных результатов, отсылая читателя к ссылкам 30-32,36-39, а также деталей, перечисленных в таблице 1, рис 1А, 2А и рис. 1. Культура клеток, соединение Подготовка и соединение цитотоксичность Выращивают соответствующую клеточную линию для системы вирусной инфекции, которые будут проанализированы (таблица 1). Для HCV, растут Ха-7,5 клеток в модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 200 Ед / мл пенициллина G, 200 мкг / мл стрептомицина и 0,5 мкг / мл амфотерицина В. Подготовка тестовых соединений и управления с использованием их соответствующих растворителей, например, растворить CHLA и Мопс в диметилсульфоксиде (ДМСО); подготовки гепарин в стерильной бидистиллированной воды. Для всех последующих разведений, используйте питательные среды. Примечание: окончательное ОБОГАЩЕНИЯРацион ДМСО в тест-соединение лечения является менее 1% в экспериментах; 1% ДМСО входит в качестве отрицательного контроля лечения в анализах для сравнения. Определить цитотоксичность испытуемых соединений (например, CHLA и Мопсом) на клетки для вирусной инфекции с помощью жизнеспособность клеток определяющую реагентом, таким как ХТТ (2,3-бис [2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил] -5-ил) карбонил] -2Н-тетразолия гидроксида): Для ВГС, семена Хух-7,5 клеток в 96-луночного планшета (1 × 10 4 клеток на лунку) и инкубировать при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатора в O / N, чтобы получить монослой. Применение контроля ДМСО (1%) или увеличение концентрации испытуемых соединений CHLA и PUG (напр. 0, 10, 50, 100 и 500 мкм) с культурой скважин в трех экземплярах. Инкубируют при 37 ° С в течение 72 ч, а затем выбросить среды в пластине и промыть клетки с 200 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) дважды. Добавить 100 мкл assayinг раствора из ХТТ основе набора в пробирке токсикологии анализа в каждую лунку и инкубируют планшеты при 37 ° С в течение еще ​​3 ч, чтобы позволить ХТТ формазана производства. Определить оптическую плотность с помощью микропланшет-ридера в тестовом волны 492 нм и длине волны сравнения 690 нм. Рассчитывают процент выживших клеток по следующей формуле: Жизнеспособность клеток (%) = В / В × 100%, где "в" и "В" относятся к поглощению испытуемых соединений и контроля растворителя (EX 1% ДМСО. ) процедуры, соответственно. Определить концентрацию 50% клеточной цитотоксичности (CC 50) испытуемых соединений с аналитическим программным обеспечением, такие как GraphPad Prism в соответствии с протоколом производителя. 2. Считывание вирусной инфекции Примечание: считывание вирусной инфекции зависит от используемой системы вируса и может включать такие методы, как налет анализов или МЭАряя репортер сигналы от репортеров-тегами вирусов. Способ диагностики инфекции репортер-ВГС на основе люциферазы активности описан ниже. Собирают супернатанты от инфицированных скважин и уточнить при 17000 х г в микроцентрифуге в течение 5 мин при 4 ° С. Смешайте 20 мкл тестируемого супернатанта к 50 мкл субстрата люциферазы из анализа люциферазы комплект Gaussia и непосредственно измерить с люминометра в соответствии с инструкциями изготовителя. Экспресс инфекционность вируса гепатита как журнал 10 относительных световых единицах (RLU) для определения вирусной ингибирование (%) и вычислить 50% эффективную концентрацию (EC 50) испытуемых соединений против инфекции HCV, используя алгоритмы из программного обеспечения GraphPad Prism в соответствии с протоколом производителя. 3. Анализ вирусной инактивации Примечание: Примеры инкубационного периода и вирусные дозы для различных Вирусыповторно перечислены на фиг.1А. Более высокие концентрации вируса также могут быть проверены путем увеличения МВД / ОРП. Семенной Ха-7,5 клеток в 96-луночный планшет (1 × 10 4 клеток на лунку) и инкубируют при 37 ° С в 5% СО 2 инкубаторе O / N, чтобы получить монослой. Инкубируйте тестируемых соединений или управления (окончательные концентрации: CHLA = 50 мкМ; МОПС = 50 мкМ; гепарин = 1000 мкг / мл; ДМСО = 1%) с частицами HCV при 37 ° С (фиг.1А, "Long-Term" ) в соотношении 1: 1. Например, для вирусной посевного 100 мкл, содержащей 1 х 10 4 ФФУ, добавить 100 мкл рабочего разведения в 100 мкМ CHLA; это дает лечение CHLA в конечной концентрации 50 мкМ. Развести смесь вирус-наркотиков, чтобы "субтерапевтическая" (неэффективной) концентрации испытуемых соединений. Например, неэффективная концентрация CHLA и PUG против ВГС на 1 мкМ 31; следовательноэто требует 50-кратное разбавление смеси вируса лекарственной которые могут быть выполнены с 9,8 мл базальной среды (среды для культивирования клеток с 2% FBS). Примечание: Разбавление до субтерапевтическом концентрации предотвращает значительное взаимодействие между тестируемыми соединениями и поверхности клетки-хозяина и позволяет исследовать эффект лечения на вирионов бесклеточных. Заметим, что это разбавление зависит от противовирусного ответа дозы испытуемых соединений против конкретного вирусной инфекции, и определяется перед выполнением этой конкретной анализа 31. Для сравнения, смешать с вирусом испытуемых соединений и сразу не развести (не инкубационный период) к югу от терапевтической концентрации до заражения (рис 1А ", краткосрочный рейтинг"). Добавить 100 мкл разбавленной смеси ВГС лекарственной на Huh-7,5 монослоя клеток (количество вируса в настоящее время находится 1 х 10 2 ФФУ; конечная МВД = 0,01) и инкубируют в течение 3 ч при 37 ° С, чтобы позволить вирусныйадсорбции. После инфекции, удалить разбавленный инокулята и осторожно мыть скважин с 200 мкл PBS в два раза. Примечание: Выполните моет осторожно, чтобы избежать подъема клеток. Применение 100 мкл минимальной среды в каждую лунку и инкубируют при 37 ° С в течение 72 ч. Анализ полученного инфекции путем анализа супернатанта на активность люциферазы, как описано в "2. Считывание вирусной инфекции. 4. Вирусный Приложение Анализ Примечание: Примеры инкубационного периода и вирусной дозы для различных вирусов, перечислены на фиг.2А, "Приложение". Более высокие концентрации вируса также могут быть проверены путем увеличения МВД / ОРП. Семенной Ха-7,5 клеток в 96-луночный планшет (1 × 10 4 клеток на лунку) и инкубируют при 37 ° С в 5% СО 2 инкубаторе O / N, чтобы получить монослой. Предварительно охладить монослоев клеток в планшеты при 4 ° С FOR 1 ч. Совместное лечение клеток с инокулята HCV (MOI = 0,01) и тестируемые соединения или управления (конечные концентрации являются: CHLA = 50 мкМ; МОПС = 50 мкМ; гепарин = 1000 мкг / мл; ДМСО = 1%) при 4 ° С в течение 3 ч. Например, в вирус инокулята, содержащего 90 мкл 1 × 10 2 ФФУ, добавить 10 мкл готового раствора 500 мкМ CHLA; это дает лечение CHLA в конечной концентрации 50 мкМ и инфекцию ВГС в МВД = 0,01 на клеточный монослой. Примечание: Важно провести эксперимент при 4 ° С, так как это позволяет вируса связывания, но исключает запись, которая наиболее эффективно происходит при температуре 37 ° С. Выполнение добавление вирусных и тестируемых соединений на льду и последующий инкубации в 4 ° C холодильником для того, чтобы поддерживать температуру на уровне 4 ° C. Удалить супернатант и осторожно мыть клеточный монослой с 200 мкл охлажденного льдом PBS дважды. Примечание: Выполните моет осторожно, чтобы избежать подъема клеток <./ LI> Применение 100 мкл минимальной среды в каждую лунку и инкубируют при 37 ° С в течение 72 ч. Анализ полученного инфекции путем анализа супернатанта на активность люциферазы, как описано в "2. Считывание вирусной инфекции. 5. Вирусный входа / Fusion Анализ Примечание: Пример инкубационного периода и вирусной дозы для различных вирусов перечислены на фигуре 2a 'входа / Fusion ". Более высокие концентрации вируса также могут быть проверены путем увеличения МВД / ОРП. Семенной Ха-7,5 клеток в 96-луночный планшет (1 × 10 4 клеток на лунку) и инкубируют при 37 ° С в 5% СО 2 инкубаторе O / N, чтобы получить монослой. Предварительно охладить монослоев клеток в планшеты при 4 ° С в течение 1 часа. Инфицировать клетки с HCV (MOI = 0,01) при 4 ° С в течение 3 ч. Например, можно использовать вирусную прививочный 100 мкл, содержащую 1 х 10 2 ФФУ. Примечание: Выполните Аддиции вирусной посевного материала на льду и последующего инкубации в 4 ° C холодильником, чтобы поддерживать температуру в 4 ° С, что позволяет вирусной связывания, но не запись. Удалить супернатант и осторожно мыть монослоев клеток с 200 мкл охлажденного льдом PBS дважды. Примечание: Выполните моет осторожно, чтобы избежать подъема клеток. Treat лунки тестовых соединений или управления (конечные концентрации являются: CHLA = 50 мкМ; МОПС = 50 мкМ; гепарин = 1000 мкг / мл; ДМСО = 1%) и инкубируют при 37 ° С в течение 3 ч. Например, добавьте 10 мкл рабочего разведения 500 мкМ CHLA 90 мкл среды, перемешать, и лечить скважин; это дает лечение CHLA в конечной концентрации 50 мкМ. Примечание: Переход от 4 ° С до 37 ° С в настоящее время облегчает вирусную событие входа / сварки и, следовательно, позволяет оценить эффект испытуемых соединений по этой "конкретной стадии. Аспирируйте наркотиков, содержащих супернатант и удаления не усвоенывнеклеточные вирусы либо промыванием 200 мкл цитратного буфера (50 мМ цитрат натрия, 4 мМ хлорида калия, рН 3,0) или PBS. Применение 100 мкл минимальной среде перед инкубацией при 37 ° С в течение 72 ч. Анализ полученного инфекции путем анализа супернатанта на активность люциферазы, как описано в "2. Считывание вирусной инфекции.

Representative Results

На рисунке 1, "вирусная инактивация анализ" было проведено с целью изучить ли два конкретных природных соединений CHLA и мопс может инактивировать различные вирусов с оболочкой в бесклеточной государства и предотвратить последующую инфекцию. Ответ на дозу цитотоксичность и противовирусную этих соединений были определены перед выполнением механистическую исследование 31. Эти вирусы были предварительно обработаны испытуемыми соединениями, а затем смеси вирус-лекарственное средство разбавляли до суб-терапевтических концентраций, прежде чем прививки на соответствующий монослоя клеток для каждого вируса системы. Как показано на рисунке 1, и CHLA и МОПС-видимому, взаимодействуют с вирионов бесклеточных, в результате чего необратимых эффектов, которые защищали клеточный монослой из последующего инфицирования. Два испытания соединения достигается почти 100% -ное ингибирование против HCMV, ВГС и DENV-2, в то время как 60 а – 80% блок наблюдалось против М.В. и RSV. Эти результаты suggТекущая что CHLA и мопс есть прямое воздействие на этих свободных вирусных частиц по их инактивации и нейтрализации инфекционность. На рисунке 2, привязанность и ввода / слияния анализы были проведены для изучения эффекта CHLA и PUG против этих ранних вирусных событий входа связанных с HCMV, ВГС, DENV-2, М., и RSV. Оба CHLA и мопс эффективно предотвратить связывание исследуемых вирусов на соответствующей клетке-хозяине, как показано ингибирование на полученной вирусной инфекции (рис 2, '' Attachment: светло-серый бар). Ингибирующий эффект на вложение вируса от обоих соединений были похожи HCMV (Фигура 2В), HCV (фиг.2с), DENV-2 (рис 2D) и РСВ (рис 2F), от 90 – 100%. С другой стороны, МОПС оказались более эффективными, чем CHLA против MV связывания (рис 2E), со скоростью ингибирования от TWO соединения различной между 50 – 80%. Лечение управления гепарин, который, как известно, чтобы блокировать проникновение вирусов, многие также ингибирует прикрепление HCMV, DENV-2, RSV, объявление MV, но менее эффективным в отношении HCV. Последовавшая "вирусный вход / слияние анализ" рассматривается CHLA и мопс сохранил ли свою деятельность на этапе входа в вирус / слияния (рис 2, "Вступление / Fusion": темные серые полосы). Опять же, как и CHLA МОПС наблюдались эффективно снижать вирусную шаг записи / слияния вирусов исследованных (Фигура 2В – F), что дает 50 – 90% защитное действие на соответствующем монослоя клеток. Гепарин также мощно ингибирует вход / слияние в DENV-2 и RSV инфекций, но менее эффективны против HCMV, ВГС и MV (<40% ингибирование в среднем). Вирус Тип клетки ЦМВ <TD> HEL ВГС Хух-7,5 DENV-2 Веро М.В. СНО-SLAM RSV Нер-2 Таблица 1:. Тип клетки-хозяина для вирусной инфекции типа клеток используется для каждой вирусной инфекции системе, описанной в представительных результатов указывается. Дополнительные подробности, касающиеся клетки могут быть найдены в справочнике 31. Рисунок 1. Инактивация вирусных инфекций к CHLA тестируемых соединений и PUG Различные вирусы были обработаны испытуемыми соединениями в течение длительного периода. (Инкубируют в течение 1,5 – 3 часов, прежде чем титрования; светло-серые столбики) или короткий период (сразу разводили; темно-серый бары) при 37 ° С до разведении в суб-терапевтических Concentraние и последующий анализ инфекции на соответствующий клеток-хозяев. (А) Схема эксперимента (показана слева) с конечной концентрации вируса (БОЕ / хорошо или МВД), долгосрочные период вируса наркотиков Инкубационный (я), и последующее время инкубации (II) указывается для каждого вируса в таблице справа. Анализы для (В) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2 (Е) М.В., (F), РСВ указаны в каждом дополнительном панели. Результаты приведены в отношении ДМСО отрицательной контрольной обработки для вирусной инфекции и данными, показанными являются средние значения ± стандартная ошибка среднего (SEM) от трех независимых экспериментов. Эта цифра была изменена с ссылкой на 31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2. Оценка противовирусной активности в CHLA тестируемых соединений и PUG против вируса прикрепления и входа / слияния. (А) Экспериментальная процедура, концентрация вируса (БОЕ / лунку или МВД), а время сложения и обработки тестируемых соединений (I, II, III) представлены для каждого вируса в схемах и таблицах связанных. В анализе связывания вируса (светло серые столбцы), монослои клеток различных типов предварительно охлажденным при 4 ° С в течение 1 ч, затем совместно обрабатывали соответствующих вирусов и испытуемых соединений при 4 ° С (1,5 – 3 ч; I) Перед смывая прививает и испытания соединений для последующей инкубации (37 ° С; II) и экспертиза вирусной инфекции. В вирусной записи / анализа синтеза (темно-серые столбцы), отобранный клеточные монослои были предварительно охлажденной при 4 ° С в течение 1 ч, а затем заражали соответствующих вирусов при температуре 4 ° С в течение 1,5 – 3 часов (I). Затем клеткипромывали и обрабатывали испытуемыми соединениями в течение дополнительного периода инкубации (II), в течение которого температура была сдвинута до 37 ° С, чтобы облегчить вирусной событие входа / фьюжн. В конце инкубации, внеклеточные вирусы были удалены либо цитратном буфере (рН 3,0) или PBS стирок и клетки дополнительно инкубировали (III) для анализа вирусной инфекции. Результаты для (В) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2 (Е) М.В., (F), РСВ указаны в каждом дополнительном панели. Данные приведены по отношению к ДМСО отрицательной контрольной обработки вирусной инфекции и представлены в виде ± SEM трех независимых экспериментов. Эта цифра была изменена с ссылкой на 31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

In this report the methods to identify and evaluate antiviral compounds based on a mechanistic approach of dissecting the early viral entry events were described. Specifically, the assays allowed us to examine the effect of test compounds on free virus particles, viral attachment, and viral entry/fusion. Critical steps were implemented to distinctly evaluate the drug effect on the specific stage of early viral entry. For instance, in the ‘viral inactivation assay’, the dilution of the virus-drug mixture to sub-therapeutic concentration prevents significant interaction between the test compound and the host cell surface by ‘titrating out’ the drug. This ensures that the inhibitory effect observed on the subsequent infection of the host cell is due to a direct interaction between the test compound and the cell-free virions, rather than an effect from the test compound on host cell membrane or membrane-associated molecules, including viral receptors30. Similarly, the shift in temperature between 4 °C (which allows for virus binding but not entry) and 37 °C (which facilitates virus entry/fusion) in the ‘viral attachment assay’ and ‘viral entry/fusion assay’ are crucial to determine the test compound’s effect on each of these specific events. This is feasible due to the temperature sensitivity of enveloped viruses during these steps in the infection24-29. It is therefore important that the assays are performed at the indicated temperature to ensure the accuracy of the results; for example, by carrying out the experiment on ice to maintain at 4 °C and by placing the sample directly in a 37 °C incubator for the temperature shift. In addition, the use of negative (ex. DMSO solvent for drug preparation) and positive (ex. heparin treatment) controls also help further establish the assays’ accuracy. The utility and applicability of such methods have been demonstrated in many antiviral studies26,30,31,40,41. Note that while heparin is included as a control for all three assays in the context of the representative results, it typically blocks the initial virus binding rather than the ensuing fusion/entry step (as reflected by the data in Figure 2). Additional controls could also be used, such as neutralizing antibodies directed against the virus (for viral inactivation assay), antibodies that mask the cell surface receptors for the virus (for viral attachment assay), and membrane fusion inhibitors (for viral fusion/entry assay).

The assays described in this report, which are specific to the early stages of the viral infection, are useful in terms of application as secondary tests to characterize the mechanism of action of candidate drugs from primary screens which typically target the viral infection more broadly. Alternatively, they could also be incorporated in primary screens if one is specifically looking for inhibitors of early viral entry, including virus inactivating agents, viral attachment antagonists, and inhibitors to viral entry/fusion. In this case, their use allows a more focused and precise screen analysis for the identification of mechanism-specific antiviral candidates, which, in turn, would expedite downstream drug development.

The use of cell-based assays in identifying antiviral agents provides several important advantages compared to biochemical assays, including revealing potential off-target effects (such as cytotoxicity) and adding physiological relevance to the bioactivity of the test agents42. These issues are important considerations for deciding whether a candidate agent is of value for continuation in subsequent phases of drug development. Similarly, the early viral entry-specific assays described in this report allow examination of the drug effect on the distinct viral entry stage at the cellular level, and more specifically in the context of an authentic viral infection in vitro. The results obtained from such assays would therefore help better predict the antiviral efficacy of the test compounds and also identify potentially unwanted off-target effects against the host cell. One potential limitation though, is that an in vitro cell-based assay may not completely reflect the actual in vivo entry step in the context of a natural viral infection. Nonetheless, the assays presented in this protocol do serve as an analytical platform for mechanism-based identification and evaluation of novel antiviral agents.

The development of reporter viruses or reporter cell systems to quantitate the amount of viral infection has greatly facilitated cell-based screening and evaluation of antiviral compounds. Examples include the use of recombinant viruses carrying a reporter gene or by means of recombinant human cell lines containing a reporter gene driven by the specific virus promoter31,43. In this report, the infection from luciferase-tagged HCV can be easily monitored by quantitating the reporter signal, thus facilitating data analysis. By incorporating these useful reporter-based tools, the early viral entry assays described here can essentially be adapted into high-throughput format for mechanism-based screening of small molecule libraries.

In conclusion, a protocol was described for assays dissecting the early viral entry as a means of identifying and evaluating mechanism-specific antiviral compounds. Such assays would be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to viral entry and help expand the scope of antiviral agents for development as prophylactic and/or therapeutic treatments.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study is supported by funding from Taipei Medical University Hospital (102TMU-TMUH-19) and the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST103-2320-B-038-031-MY3).

Materials

DMEM GIBCO 11995-040
FBS GIBCO 26140-079
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070-063
Amphotericin B GIBCO 15290-018
DMSO Sigma D5879
In vitro toxicology assay kit, XTT-based Sigma TOX2
PBS pH 7.4  GIBCO 10010023
Microplate reader Bio-Tek Instrument, Inc. ELx800 
Microcentrifuge Thermo Scientific 75002420
BioLux Gaussia luciferase assay kit New England Biolabs E3300L   
Luminometer Promega GloMax-20/20
Sodium citrate, dihydrate Sigma 71402
Potassium chloride Sigma P5405
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Munier, C. M., Andersen, C. R., Kelleher, A. D. HIV vaccines: progress to date. Drugs. 71, 387-414 (2011).
  2. Rothman, A. L. Immunity to dengue virus: a tale of original antigenic sin and tropical cytokine storms. Nat Rev Immunol. 11, 532-543 (2011).
  3. Sung, H., Schleiss, M. R. Update on the current status of cytomegalovirus vaccines. Expert Rev Vaccines. 9, 1303-1314 (2010).
  4. Torresi, J., Johnson, D., Wedemeyer, H. Progress in the development of preventive and therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J Hepatol. 54, 1273-1285 (2011).
  5. Wright, M., Piedimonte, G. Respiratory syncytial virus prevention and therapy: past, present, and future. Pediatr Pulmonol. 46, 324-347 (2011).
  6. Christou, L. The global burden of bacterial and viral zoonotic infections. Clin Microbiol Infect. 17, 326-330 (2011).
  7. Cascio, A., Bosilkovski, M., Rodriguez-Morales, A. J., Pappas, G. The socio-ecology of zoonotic infections. Clin Microbiol Infect. 17, 336-342 (2011).
  8. Grais, R. F. Measles vaccination in humanitarian emergencies: a review of recent practice. Confl Health. 5, 21 (2011).
  9. Gautret, P. Emerging viral respiratory tract infections-environmental risk factors and transmission. Lancet Infect Dis. 14, 1113-1122 (2014).
  10. Sampathkumar, P. Middle East respiratory syndrome: what clinicians need to know. Mayo Clin Proc. 89, 1153-1158 (2014).
  11. Burd, E. M. Ebola Virus: a Clear and Present Danger. J Clin Microbiol. 53, 4-8 (2015).
  12. Bishop, B. M. Potential and Emerging Treatment Options for Ebola Virus Disease. Ann Pharmacother. , (2014).
  13. Arduino, P. G., Porter, S. R. Oral and perioral herpes simplex virus type 1 (HSV-1) infection: review of its management. Oral Dis. 12, 254-270 (2006).
  14. Mitrasinovic, P. M. Advances in the structure-based design of the influenza A neuraminidase inhibitors. Curr Drug Targets. 11, 315-326 (2010).
  15. Soriano, V. Directly acting antivirals against hepatitis C virus. J Antimicrob Chemother. 66, 1673-1686 (2011).
  16. Haqqani, A. A., Tilton, J. C. Entry inhibitors and their use in the treatment of HIV-1 infection. Antiviral Res. 98, 158-170 (2013).
  17. Melby, T., Westby, M. Inhibitors of viral entry. Handb Exp Pharmacol. , 177-202 (2009).
  18. Vanderlinden, E., Naesens, L. Emerging antiviral strategies to interfere with influenza virus entry. Med Res Rev. 34, 301-339 (2014).
  19. Antoine, T. E., Park, P. J., Shukla, D. Glycoprotein targeted therapeutics: a new era of anti-herpes simplex virus-1 therapeutics. Rev Med Virol. 23, 194-208 (2013).
  20. Pawlotsky, J. M., Chevaliez, S., McHutchison, J. G. The hepatitis C virus life cycle as a target for new antiviral therapies. Gastroenterology. 132, 1979-1998 (2007).
  21. Beyleveld, G., White, K. M., Ayllon, J., Shaw, M. L. New-generation screening assays for the detection of anti-influenza compounds targeting viral and host functions. Antiviral Res. 100, 120-132 (2013).
  22. Kilianski, A., Baker, S. C. Cell-based antiviral screening against coronaviruses: developing virus-specific and broad-spectrum inhibitors. Antiviral Res. 101, 105-112 (2014).
  23. Caillet-Saguy, C., Lim, S. P., Shi, P. Y., Lescar, J., Bressanelli, S. Polymerases of hepatitis C viruses and flaviviruses: structural and mechanistic insights and drug development. Antiviral Res. 105, 8-16 (2014).
  24. Frey, S. Temperature dependence of cell-cell fusion induced by the envelope glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 69, 1462-1472 (1995).
  25. Tscherne, D. M. Time- and temperature-dependent activation of hepatitis C virus for low-pH-triggered entry. J Virol. 80, 1734-1741 (2006).
  26. Madan, R. P. Molecular umbrellas: a novel class of candidate topical microbicides to prevent human immunodeficiency virus and herpes simplex virus infections. J Virol. 81, 7636-7646 (2007).
  27. Haywood, A. M., Boyer, B. P. Time and temperature dependence of influenza virus membrane fusion at neutral pH. J Gen Virol. 67 (Pt 12), 2813-2817 (1986).
  28. Haywood, A. M., Boyer, B. P. Sendai virus membrane fusion: time course and effect of temperature, pH, calcium, and receptor concentration). 生物化学. 21, 6041-6046 (1982).
  29. Wang, G., Hernandez, R., Weninger, K., Brown, D. T. Infection of cells by Sindbis virus at low temperature. Virology. 362, 461-467 (2007).
  30. Lin, L. T. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. J Virol. 85, 4386-4398 (2011).
  31. Lin, L. T. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiol. 13, 187 (2013).
  32. Marukian, S. Cell culture-produced hepatitis C virus does not infect peripheral blood mononuclear cells. Hepatology. 48, 1843-1850 (2008).
  33. Baba, M., Snoeck, R., Pauwels, R., de Clercq, E. Sulfated polysaccharides are potent and selective inhibitors of various enveloped viruses, including herpes simplex virus, cytomegalovirus, vesicular stomatitis virus, and human immunodeficiency virus. Antimicrob Agents ChemotheR. 32, 1742-1745 (1988).
  34. Barth, H. Cellular binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparan sulfate. J Biol CheM. 278, 41003-41012 (2003).
  35. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. . Principles of Virology. , (2008).
  36. Brown, M. G. Dramatic caspase-dependent apoptosis in antibody-enhanced dengue virus infection of human mast cells. J Leukoc Biol. 85, 71-80 (2009).
  37. Huang, Y., Cyr, S. L., Burt, D. S., Anderson, R. Murine host responses to respiratory syncytial virus (RSV) following intranasal administration of a Protollin-adjuvanted, epitope-enhanced recombinant G protein vaccine. J Clin Virol. 44, 287-291 (2009).
  38. Isaacson, M. K., Compton, T. Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress. J Virol. 83, 3891-3903 (2009).
  39. Leonard, V. H., et al. Measles virus blind to its epithelial cell receptor remains virulent in rhesus monkeys but cannot cross the airway epithelium and is not shed. J Clin Invest. 118, 2448-2458 (2009).
  40. Ciesek, S. The green tea polyphenol, epigallocatechin-3-gallate, inhibits hepatitis C virus entry. Hepatology. 54, 1947-1955 (2011).
  41. Lin, L. T. Saikosaponin b2 is a naturally occurring terpenoid that efficiently inhibits hepatitis C virus entry. J Hepatol. 62, 541-548 (2015).
  42. Atkins, C., Evans, C. W., White, E. L., Noah, J. W. Screening methods for influenza antiviral drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7, 429-438 (2012).
  43. Zhang, J. Identification of novel virus inhibitors by influenza A virus specific reporter cell based screening. Antiviral Res. 93, 48-54 (2012).

Tags

Key Words:- Viral Entry Assays- Antiviral Compounds- Cell-based Systems- Viral Life Cycle- Viral Entry Stages- Viral Inactivation- Viral Attachment- Viral Entry/fusion- Hepatitis C Virus- Antiviral Assays- Antagonists- Inhibitors- Early Viral Entry- Drug Development

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Tai, C., Li, C., Tai, C., Wang, C., Lin, L. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J. Vis. Exp. (104), e53124, doi:10.3791/53124 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image