JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
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免疫与感染

Early Viral entrée dosages pour l'identification et l'évaluation des composés antiviraux

Published: October 29, 2015
doi:
10.3791/53124
, , , ,
1Department of Chinese Medicine,Taipei Medical University Hospital, 2Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, College of Medicine,Taipei Medical University, 3Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, College of Medicine,Taipei Medical University, 4Division of Hematology and Oncology, Department of Internal Medicine,Taipei Medical University Hospital, 5Department of Internal Medicine, School of Medicine, College of Medicine,Taipei Medical University, 6Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicine,Taipei Medical University

Summary

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Abstract

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Introduction

Viral infections are a constant threat to the public health and a significant cause of epidemic diseases, morbidity, and deaths worldwide. Specific modes of control against viral infections include vaccine development and antiviral therapies. While vaccine efforts have proven successful in immunizing against several viruses, many viral pathogens remain without a protective vaccine including dengue virus (DENV), human cytomegalovirus (HCMV), hepatitis C virus (HCV), human immunodeficiency virus (HIV), and respiratory syncytial virus (RSV)1-5. Antivirals, on the other hand, play an important role for the management of these viral infections when prophylactic vaccines are unavailable. However, to date, only few licensed and cost-effective antiviral drugs are available compared to the number of viral pathogens that threatens the public health. More importantly, due to an increase in global travel and rapid urbanization, the situation is aggravated by risks of epidemic outbreaks from emerging/re-emerging viral infections that are being introduced into non-indigenous areas6. Recent outbreaks caused by severe acute respiratory syndrome (SARS) virus, influenza viruses (H1N1, H5N1, H3N2, and H7N9), DENV, West Nile virus (WNV), measles virus (MV), Middle East Respiratory Syndrome (MERS) virus, and Ebola virus6-12 are among the examples reflecting the need for antivirals development when immunization and/or therapeutics are unavailable. In addition, there is always a potential risk of generating drug-resistant infections with currently used antivirals. Thus, the continuous development and expansion of the scope of antivirals to these emerging/re-emerging viral infections are necessary to provide better management strategies and safeguard the public health.

Most antiviral therapies consist of direct acting antivirals (DAAs) which target a specific viral protein or cofactor that mediates important steps in the viral life cycle. For example, the nucleoside analogue Acyclovir inhibits herpesvirus DNA polymerase, protease inhibitors Boceprevir and Telaprevir antagonize the HCV NS3, and Oseltamivir and Zanamivir are neuraminidase inhibitors that block the release of influenza virus particles from infected cells13-15. There are however very few licensed viral entry inhibitors including Enfuvirtide, which targets HIV gp41 to prevent fusion, and Maraviroc, which blocks the HIV co-receptor CCR5, thereby preventing viral entry16. Exploring novel antagonists/inhibitors to viral entry could help provide additional therapeutics for prophylactic or therapeutic use, such as in combination with other antivirals with a different mechanism of action to better manage viral infections17-19.

Identification of antivirals can involve structure-guided drug design and candidate drug screening-based strategy. Methods for assessing antiviral activity of test agents include biochemical assays of enzymatic activity and evaluation by cell-based systems20-23. In cell-based systems, the viral life cycle can be dissected into distinct stages of infection, such as entry events (attachment, fusion, uncoating), the replication phase (viral genome replication and protein translation), and virion egress (assembly, maturation, and release). Since the assays can be adapted to investigate each specific stage using various tools and methods, this approach allows identification/examination of potential candidate antivirals with a specific mechanism of action targeting the distinct stage analyzed. For instance, to analyze drug effect specifically on the free virus particles prior to binding to the host cell, a ‘viral inactivation assay’ can be performed. In this assay, the virus is allowed to incubate with the test drug and then diluted to titrate out the drug before infecting a cell monolayer. Additional steps such as viral attachment and entry/fusion stages can also be analyzed individually, by shifting the temperature during the infection. For many enveloped viruses, viral entry/fusion at the host cell membrane is greatly facilitated at 37 °C, but is typically precluded at 4 °C which does not affect virus binding24-29. Finally, the use of reporter viruses or cell systems could facilitate these studies and permit a high-throughput analysis.

We previously employed the cell-based approach and dissected the early entry of various enveloped viruses for the examination of antiviral compounds that potentially antagonize viral entry30,31. Herein, the various methods used, including viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion assays, are described.

Protocol

Remarque: Veiller à ce que toutes les procédures impliquant la culture cellulaire et infection par le virus sont menées dans les hottes de biosécurité certifiés qui sont appropriés pour le niveau des échantillons de biosécurité être manipulé. Aux fins de la description des protocoles, la luciférase de Gaussia VHC à marquage rapporteur est utilisé comme un modèle de virus 32. Dans le contexte des résultats représentatifs, l'acide des composés de chébulagique (CHLA) et punicalagin (PUG) sont utilisés comme antiviraux candidats qui ciblent les interactions avec les glycosaminoglycanes glycoprotéine virale de surface cellulaire lors de l'entrée virale premières étapes 31. L'héparine, qui est connu pour interférer avec l'entrée de nombreux virus 30,31,33,34, est utilisé comme un traitement de contrôle positif dans ce contexte. Pour des informations de base sur des techniques de virologie, la propagation de virus, la détermination du titre du virus, et l'expression de la dose infectieuse en unités formant des plages (PFU), concentrer les unités de formage (FFU), ou multiplicité d'infection (MOI), le lecteur est re35 préféré pour référencer. Pour des exemples antérieurs et des conditions optimisées utilisés pour les virus indiqués dans les résultats représentatifs, le lecteur est renvoyé aux références 30-32,36-39 ainsi que les détails figurant au tableau 1, figure 1A et la figure 2A. 1. Culture cellulaire, Préparation composé et composé de cytotoxicité Cultiver la lignée cellulaire respectif pour le système d'infection par le virus à analyser (tableau 1). Pour le HCV, cultiver les cellules Huh-7,5 dans du milieu d'Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 200 U / ml de pénicilline G, 200 ug / ml de streptomycine et 0,5 pg / ml d'amphotéricine B. Préparation des composés d'essai et les témoins en utilisant leurs solvants respectifs: par exemple, dissoudre ABSC et PUG dans le diméthylsulfoxyde (DMSO); préparer l'héparine dans l'eau double distillée stérile. Pour tous les autres dilutions, utiliser des milieux de culture. Remarque: Le concent finaleration de DMSO dans les traitements composés de test est inférieure à 1% dans les expériences; 1% de DMSO est comprise comme traitement témoin négatif dans les tests de comparaison. Déterminer la cytotoxicité des composés à tester (par exemple, ABSC et PUG) sur les cellules pour l'infection virale en utilisant une viabilité cellulaire déterminer réactif tel que le XTT (2,3-bis [2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl] -5-phénylamino) carbonyl] -2H-tétrazolium hydroxyde): Pour le VHC, ensemencer 7,5 Huh-cellules dans une plaque de 96 puits (1 x 10 4 cellules par puits) et incuber à 37 ° C dans un 5% de CO 2 incubateur O / N pour obtenir une monocouche. Appliquer témoin de DMSO (1%) ou des concentrations croissantes de composés d'essai ABSC et PUG (ex. 0, 10, 50, 100, et 500 pM) dans les puits de culture en triple exemplaire. Incuber à 37 ° C pendant 72 heures, puis jeter le milieu dans la plaque et laver les cellules avec 200 pi de tampon phosphate salin (PBS) deux fois. Ajouter 100 pi de assaying de solution du kit test in vitro en toxicologie-XTT dans chaque puits et incuber les plaques à 37 ° C pendant encore 3 heures pour permettre la production XTT formazan. Déterminer l'absorbance avec un lecteur de microplaques à une longueur d'onde de test de 492 nm et une longueur d'onde de 690 nm de référence. Calculer le pourcentage de survie des cellules en utilisant la formule suivante: viabilité cellulaire (%) = A / As x 100%, où «A» et «sous» se référer à l'absorbance des composés d'essai et le témoin de solvant (par exemple 1% de DMSO. ) traitements, respectivement. Déterminer la concentration de 50% de cytotoxicité cellulaire (CC 50) des composés d'essai à partir d'un logiciel d'analyse tel que GraphPad Prism selon le protocole du fabricant. 2. Lecture de l'infection virale Remarque: La lecture d'une infection virale dépend du système de virus utilisé et peut impliquer des procédés tels que des dosages de plaques ou meaSuring signaux rapporteurs de virus rapporteurs marqués. Procédé pour détecter une infection par le VHC reporter sur la base de l'activité rapporteur de la luciférase est décrite ci-dessous. Recueillir les surnageants des puits infectés et de clarifier à 17.000 xg dans une microcentrifugeuse pendant 5 min à 4 ° C. Mélanger 20 ul de surnageant de test à 50 ul de substrat de la luciférase à partir de la trousse de dosage de la luciférase de Gaussia et de mesurer directement avec un luminomètre selon les instructions du fabricant. Exprimer HCV infectieux tel que log 10 d'unités lumineuses relatives (RLU) de détermination de l'inhibition virale (%) et de calculer la concentration efficace 50% (EC50) des composés d'essai contre une infection par le VHC en utilisant des algorithmes de logiciel GraphPad Prism selon le protocole du fabricant. 3. Inactivation virale Assay Remarque: Des exemples de période d'incubation et la dose virale de différents virus aRE admises à la figure 1A. Des concentrations plus élevées de virus peuvent également être testés en augmentant le MOI / PFU. Graine Huh-7.5 cellules dans une plaque à 96 puits (1 x 10 4 cellules par puits) et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% O / N afin d'obtenir une monocouche. Incuber les composés ou des contrôles essai (concentrations finales sont: CHLA = 50 uM; PUG = 50 uM; héparine = 1,000 ug / ml; DMSO = 1%) avec les particules de VHC à 37 ° C (figure 1A, «à long terme» ) dans un rapport de 1: 1. Par exemple, pour un inoculum de virus de 100 pi contenant 1 x 10 4 FFU, ajouter 100 ul d'une dilution de travail de 100 uM ABSC; on obtient de l'ABSC traitement à une concentration finale de 50 uM. On dilue le mélange virus-drogue de concentration (sans effet) "sous-thérapeutique" des composés d'essai. Par exemple, la concentration inefficace de l'ABSC et PUG contre le VHC est à 1 uM 31; doncceci nécessite une dilution de 50 fois du mélange virus-médicament qui peut être accompli avec 9,8 ml de milieu basal (milieu de culture cellulaire avec 2% de FBS). Remarque: La dilution à la concentration de sous-thérapeutique empêche l'interaction significative entre les composés d'essai et la surface de la cellule hôte et permet l'examen de l'effet du traitement sur les virions exempts de cellules. Notez que cette dilution est dépendante de la dose-réponse antivirale des composés d'essai contre l'infection virale particulière, et il est déterminé avant de réaliser cet essai particulier 31. A titre de comparaison, le virus mélanger avec les composés d'essai et dilué immédiatement (pas de période d'incubation) de concentration sub-thérapeutique avant l'infection (Figure 1A, «à court terme»). Ajouter 100 pi du mélange VHC-médicament dilué sur le Huh-7,5 monocouche de cellules (la quantité de virus est maintenant à 1 x 10 2 FFU; finale MOI = 0,01) et incuber pendant 3 heures à 37 ° C pour permettre viraleadsorption. Suite à l'infection, retirer le inoculum dilué et laver délicatement les puits avec 200 pi de PBS deux fois. Remarque: Effectuez les lavages doucement pour éviter de soulever les cellules. Appliquer 100 pi de milieu de base à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 72 heures. Analyser l'infection résultant en testant le surnageant pour l'activité luciférase comme décrit dans '2. Lecture d'une infection virale. 4. virale Attachment Assay Remarque: Les exemples de la période d'incubation et la dose virale pour divers virus sont répertoriés dans la figure 2A, «attachement». Des concentrations plus élevées de virus peuvent également être testés en augmentant le MOI / PFU. Graine Huh-7.5 cellules dans une plaque à 96 puits (1 x 10 4 cellules par puits) et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% O / N afin d'obtenir une monocouche. Pré-refroidir les monocouches de cellules dans des plaques à 4 ° C for 1 h. Co-traiter les cellules infectées par le VHC inoculum (MOI = 0,01) et les composés d'essai ou de contrôle (concentrations finales sont: CHLA = 50 uM; PUG = 50 uM; héparine = 1,000 ug / ml; DMSO = 1%) à 4 ° C pour 3 h. Par exemple, pour un inoculum de virus de 90 ul contenant 1 x 10 2 FFU, ajouter 10 ul d'une dilution de travail de 500 uM ABSC; on obtient de l'ABSC traitement à une concentration finale de 50 uM et une infection par le VHC à une MOI = 0,01 sur la monocouche cellulaire. Remarque: Il est important de réaliser l'expérience à 4 ° C, car elle permet la liaison du virus mais empêche l'entrée qui se produit le plus efficacement à 37 ° C. Effectuer l'addition de composés de virus et de test sur de la glace et l'incubation qui a suivi dans un réfrigérateur à 4 C ° pour garantir que la température est maintenue à 4 ° C. Retirer le surnageant et laver délicatement la monocouche cellulaire avec 200 pi de PBS glacé deux fois. Remarque: Effectuez les lavages doucement pour éviter de soulever les cellules <./ li> Appliquer 100 pi de milieu de base à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 72 heures. Analyser l'infection résultant en testant le surnageant pour l'activité luciférase comme décrit dans '2. Lecture d'une infection virale. 5. virale Entrée / Fusion Assay Remarque: Exemple de périodes d'incubation et dose virale pour divers virus sont répertoriés dans 'Entrée / Fusion' Figure 2A. Des concentrations plus élevées de virus peuvent également être testés en augmentant le MOI / PFU. Graine Huh-7.5 cellules dans une plaque à 96 puits (1 x 10 4 cellules par puits) et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5% O / N afin d'obtenir une monocouche. Pré-refroidir les monocouches de cellules dans des plaques à 4 ° C pendant 1 heure. Infecter les cellules infectées par le VHC (MOI = 0,01) à 4 ° C pendant 3 heures. Par exemple, utiliser un inoculum viral 100 ul contenant 1 x 10 2 FFU. Remarque: Effectuez l'Addition de l'inoculum viral sur de la glace et l'incubation qui a suivi dans un réfrigérateur à 4 C ° pour maintenir la température à 4 ° C, ce qui permet l'entrée virale, mais non obligatoire. Retirer le surnageant et laver délicatement les monocouches de cellules avec 200 pi de PBS glacé deux fois. Remarque: Effectuez les lavages doucement pour éviter de soulever les cellules. Traiter les puits avec les composés d'essai ou de contrôle (concentrations finales sont les suivantes: 50 uM = ABSC; PUG = 50 uM; héparine = 1,000 ug / ml; DMSO = 1%) et incuber à 37 ° C pendant 3 heures. Par exemple, ajouter 10 ul d'une dilution de travail 500 um CHLA à 90 pi de milieu, mélanger, et de traiter les puits; on obtient de l'ABSC traitement à une concentration finale de 50 uM. Remarque: Le passage de 4 ° C à 37 ° C facilite désormais l'événement d'entrée / fusion virale et permet donc l'évaluation de l'effet de composés de test sur cette étape particulière. Aspirer le surnageant contenant le médicament et enlever non intérioriséles virus extracellulaires, soit par lavage avec 200 ul de tampon citrate (citrate de sodium 50 mM, chlorure de potassium 4, pH 3,0) ou du PBS. Appliquer 100 ul de milieu de base avant l'incubation à 37 ° C pendant 72 h. Analyser l'infection résultant en testant le surnageant pour l'activité luciférase comme décrit dans '2. Lecture d'une infection virale.

Representative Results

Dans la figure 1, le «test d'inactivation virale» a été réalisée pour examiner si deux composés naturels CHLA et PUG spécifiques pourraient inactiver les virus enveloppés dans différents état ​​libre-cellulaire et prévenir l'infection ultérieure. La réponse à la dose antivirale et la cytotoxicité de ces composés ont été déterminées avant l'exécution de l'étude mécaniste 31. Les virus ont été pré-traitées avec les composés d'essai et ensuite les mélanges virus-médicament ont été dilués à des concentrations sous-thérapeutiques avant l'inoculation sur la monocouche de cellule respectif pour chaque système de virus. Comme le montre la figure 1, les deux ABSC et PUG sont apparus pour interagir avec les virions exempts de cellules, ce qui entraîne des effets irréversibles qui protégeaient la monocouche de cellules à partir de l'infection ultérieure. Les deux composés d'essai réalisé un près de 100% d'inhibition contre le HCMV, le VHC et DENV-2, alors qu'un 60 – bloc 80% a été observée contre MV et RSV. Ces résultats SuggEst ce que l'ABSC et PUG ont un impact direct sur ces particules virales libres en les neutralisant l'inactivation et leur infectivité. Dans la figure 2, l'attachement et d'entrée / essais de fusion ont été réalisées pour étudier l'effet de l'ABSC et PUG contre ces événements virales précoces liées entrée-de HCMV, VHC, DENV-2, MV, et RSV. Les deux CHLA et PUG efficacement empêché liaison des virus étudiés sur la cellule hôte respective comme indiqué par l'inhibition de l'infection virale résultante (Figure 2, «attachement»: barres gris clair). L'effet inhibiteur sur l'attachement du virus par les deux composés était semblable contre HCMV (figure 2B), le VHC (figure 2C), DENV-2 (figure 2D), et RSV (Figure 2F), allant de 90 – 100%. D'autre part, PUG semblait être plus efficace que l'ABSC contre MV liaison (Figure 2E), le taux de la tw d'inhibitioncomposés o variant entre 50 – 80%. L'héparine de traitement de commande, qui est connu pour bloquer l'entrée de nombreux virus, aussi inhibé la fixation de HCMV, DENV-2, RSV, annonce MV, mais est moins efficace contre le VHC. Le suivi 'essai entrée / fusion virale' examiner si CHLA et PUG ont conservé leur activité au cours de la phase entrée du virus / fusion (Figure 2, 'Entrée / Fusion ": barres gris foncé). Encore une fois, les deux ABSC et PUG ont été observés à altérer efficacement l'étape d'entrée / de fusion virale des virus examinés (Figure 2B – F), ce qui donne un 50 – effet protecteur de 90% sur la monocouche de cellule respectif. Héparine aussi puissamment inhibé entrée / fusion dans DENV-2 et les infections à VRS, mais était moins efficace contre le HCMV, le VHC et MV (<40% d'inhibition en moyenne). Virus Type de cellule HCMV <td> HEL VHC Huh-7.5 DENV-2 Vero MV CHO-SLAM RSV HEp-2 Tableau 1:. Hôte type de cellule à une infection virale du type de cellule utilisé pour chaque système d'infection virale décrit dans les résultats représentatifs est indiquée. Des détails supplémentaires concernant les cellules peuvent être trouvés dans la référence 31. Figure 1. L'inactivation des infections virales par les composés de test CHLA et PUG Différents virus ont été traités avec les composés d'essai pendant une longue période. (Incubé pendant 1,5 à 3 h avant le titrage; barres gris clair) ou une période courte (dilué immédiatement; gris foncé bars) à 37 ° C avant une dilution de concentration sub-thérapeutiquetion et l'analyse ultérieure de l'infection sur les cellules hôtes respectives. (A) Schéma de l'expérience (montré sur la gauche) avec la concentration de virus final (PFU / puits ou MOI), à long terme période virus médicament incubation (i), et le temps d'incubation subséquente (ii) indiqué pour chaque virus dans le tableau sur la droite. Les analyses de (B) de HCMV, (C) le VHC, (D) DENV-2, (E) MV, et (F) de RSV sont indiqués dans chaque panneau supplémentaire. Les résultats sont tracées en fonction du traitement de contrôle négatif DMSO pour infection par le virus ainsi que les données représentées sont les moyennes ± l'erreur-type de la moyenne (SEM) à partir de trois expériences indépendantes. Ce chiffre a été modifié de la référence 31. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2. L'évaluation des activités antivirales de composés d'essai ABSC et PUG contre l'attachement du virus et l'entrée / fusion. (A) Le mode opératoire expérimental, la concentration en virus (PFU / puits ou MOI), et le moment de l'addition et le traitement avec les composés d'essai (i, ii, iii) sont présentés pour chaque virus dans les schémas et les tableaux associés. Dans l'analyse de fixation de virus (barres gris clair), des monocouches de différents types de cellules ont été pré-refroidi à 4 ° C pendant 1 heure, puis co-traités avec les virus respectifs et les composés d'essai à 4 ° C (1,5 – 3 h, i) avant de rincer les inoculats et les composés d'essai à une incubation ultérieure (37 ° C, ii) et de l'examen de l'infection par le virus. Dans l'entrée du virus / analyse de fusion (barres gris foncé), des monocouches de cellules ensemencées ont été pré-refroidi à 4 ° C pendant 1 h et ensuite provoqués avec chacun des virus à 4 ° C pendant 1,5 – 3 h (i). Les cellules ont ensuitelavé et traité avec des composés d'essai pendant une période d'incubation supplémentaire (ii) au cours de laquelle la température a été décalé à 37 ° C pour faciliter l'événement d'entrée / fusion virale. A la fin de l'incubation, les virus extracellulaires ont été retirés soit par un tampon citrate (pH 3,0) ou lavages au PBS et les cellules ont été encore incubées (iii) pour l'analyse d'une infection par virus. Résultats pour (B) HCMV, (C) le VHC, (D) DENV-2, (E) MV, et (F) RSV sont indiqués dans chaque panneau supplémentaire. Les données sont tracées en fonction du traitement de contrôle négatif de DMSO infection par le virus et sont présentées comme moyenne ± SEM à partir de trois expériences indépendantes. Ce chiffre a été modifié de la référence 31. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

In this report the methods to identify and evaluate antiviral compounds based on a mechanistic approach of dissecting the early viral entry events were described. Specifically, the assays allowed us to examine the effect of test compounds on free virus particles, viral attachment, and viral entry/fusion. Critical steps were implemented to distinctly evaluate the drug effect on the specific stage of early viral entry. For instance, in the ‘viral inactivation assay’, the dilution of the virus-drug mixture to sub-therapeutic concentration prevents significant interaction between the test compound and the host cell surface by ‘titrating out’ the drug. This ensures that the inhibitory effect observed on the subsequent infection of the host cell is due to a direct interaction between the test compound and the cell-free virions, rather than an effect from the test compound on host cell membrane or membrane-associated molecules, including viral receptors30. Similarly, the shift in temperature between 4 °C (which allows for virus binding but not entry) and 37 °C (which facilitates virus entry/fusion) in the ‘viral attachment assay’ and ‘viral entry/fusion assay’ are crucial to determine the test compound’s effect on each of these specific events. This is feasible due to the temperature sensitivity of enveloped viruses during these steps in the infection24-29. It is therefore important that the assays are performed at the indicated temperature to ensure the accuracy of the results; for example, by carrying out the experiment on ice to maintain at 4 °C and by placing the sample directly in a 37 °C incubator for the temperature shift. In addition, the use of negative (ex. DMSO solvent for drug preparation) and positive (ex. heparin treatment) controls also help further establish the assays’ accuracy. The utility and applicability of such methods have been demonstrated in many antiviral studies26,30,31,40,41. Note that while heparin is included as a control for all three assays in the context of the representative results, it typically blocks the initial virus binding rather than the ensuing fusion/entry step (as reflected by the data in Figure 2). Additional controls could also be used, such as neutralizing antibodies directed against the virus (for viral inactivation assay), antibodies that mask the cell surface receptors for the virus (for viral attachment assay), and membrane fusion inhibitors (for viral fusion/entry assay).

The assays described in this report, which are specific to the early stages of the viral infection, are useful in terms of application as secondary tests to characterize the mechanism of action of candidate drugs from primary screens which typically target the viral infection more broadly. Alternatively, they could also be incorporated in primary screens if one is specifically looking for inhibitors of early viral entry, including virus inactivating agents, viral attachment antagonists, and inhibitors to viral entry/fusion. In this case, their use allows a more focused and precise screen analysis for the identification of mechanism-specific antiviral candidates, which, in turn, would expedite downstream drug development.

The use of cell-based assays in identifying antiviral agents provides several important advantages compared to biochemical assays, including revealing potential off-target effects (such as cytotoxicity) and adding physiological relevance to the bioactivity of the test agents42. These issues are important considerations for deciding whether a candidate agent is of value for continuation in subsequent phases of drug development. Similarly, the early viral entry-specific assays described in this report allow examination of the drug effect on the distinct viral entry stage at the cellular level, and more specifically in the context of an authentic viral infection in vitro. The results obtained from such assays would therefore help better predict the antiviral efficacy of the test compounds and also identify potentially unwanted off-target effects against the host cell. One potential limitation though, is that an in vitro cell-based assay may not completely reflect the actual in vivo entry step in the context of a natural viral infection. Nonetheless, the assays presented in this protocol do serve as an analytical platform for mechanism-based identification and evaluation of novel antiviral agents.

The development of reporter viruses or reporter cell systems to quantitate the amount of viral infection has greatly facilitated cell-based screening and evaluation of antiviral compounds. Examples include the use of recombinant viruses carrying a reporter gene or by means of recombinant human cell lines containing a reporter gene driven by the specific virus promoter31,43. In this report, the infection from luciferase-tagged HCV can be easily monitored by quantitating the reporter signal, thus facilitating data analysis. By incorporating these useful reporter-based tools, the early viral entry assays described here can essentially be adapted into high-throughput format for mechanism-based screening of small molecule libraries.

In conclusion, a protocol was described for assays dissecting the early viral entry as a means of identifying and evaluating mechanism-specific antiviral compounds. Such assays would be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to viral entry and help expand the scope of antiviral agents for development as prophylactic and/or therapeutic treatments.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study is supported by funding from Taipei Medical University Hospital (102TMU-TMUH-19) and the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST103-2320-B-038-031-MY3).

Materials

DMEM GIBCO 11995-040
FBS GIBCO 26140-079
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070-063
Amphotericin B GIBCO 15290-018
DMSO Sigma D5879
In vitro toxicology assay kit, XTT-based Sigma TOX2
PBS pH 7.4  GIBCO 10010023
Microplate reader Bio-Tek Instrument, Inc. ELx800 
Microcentrifuge Thermo Scientific 75002420
BioLux Gaussia luciferase assay kit New England Biolabs E3300L   
Luminometer Promega GloMax-20/20
Sodium citrate, dihydrate Sigma 71402
Potassium chloride Sigma P5405
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References

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Key Words:- Viral Entry Assays- Antiviral Compounds- Cell-based Systems- Viral Life Cycle- Viral Entry Stages- Viral Inactivation- Viral Attachment- Viral Entry/fusion- Hepatitis C Virus- Antiviral Assays- Antagonists- Inhibitors- Early Viral Entry- Drug Development

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Tai, C., Li, C., Tai, C., Wang, C., Lin, L. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J. Vis. Exp. (104), e53124, doi:10.3791/53124 (2015).
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