Прижизненные микроскопия лейкоцитов и тромбоцитов эндотелиальных лейкоцитов-взаимодействия в мезентериальных вен у мышей
Summary
This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.
Abstract
Прижизненные микроскопия является методом, который может быть использован для исследования различных процессов в различных регионах и сосуды в живых животных. В этом протоколе мы опишем прижизненный микроскопии брыжейки вен. Это может быть выполнено в течение короткого периода времени с воспроизводимыми результатами, показывающими, лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия в естественных условиях. Мы описываем воспалительный настройки после ЛПС эндотелия. Но в этой модели можно применить различные типы воспалительных состояний, как бактериальных, химических или биологических и исследовать введение препаратов и их прямое воздействие на живом и его влияние на лейкоцитов. Этот протокол был успешно применен к ряду различных обработок мышей и их воздействие на воспалительную реакцию в сосудах. Здесь, мы опишем визуализацию лейкоцитов и тромбоцитов флуоресцентно маркировка их с родамина 6G. Кроме того, любая конкретная изображений может быть реrformed помощью целенаправленных флуоресцентно меченных молекул.
Introduction
Целью данного протокола является описание упрощенную методику прижизненной микроскопии брыжейки вен в живых мышей для прямого наблюдения лейкоцитов-эндотелиальной и лейкоцитов тромбоцитов взаимодействий при воспалительных процессах.
Прижизненные микроскопии был разработан для изучения лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия в естественных условиях под воспалительных состояний 1,2, что не тривиальна, но важно для понимания воспалительной лейкоцитов и функции. Метод, который мы описали в этом протоколе был разработан на основе ранее опубликованных изданий. Подобно визуализации тромбоцитов включение в растущем тромба 3 и параллельно с тем, что было опубликовано ранее 4, выводили брыжейки вена рассмотрены передаваемой световой микроскопии. Есть различные другие модели внутри витал микроскопии, такие как кремастер мышцы крыс 5 или печени мыши и крысы 6.
Прижизненные микроскопия брыжейки вены была разработана и применяется в предыдущих исследованиях несколько групп. Мы использовали эту технику, чтобы наблюдать различия в лейкоцитов между мышами дикого типа и триптофана hydroxylase1 (Tph1) – / – мышей, которые дефицитный ненейронных серотонина и сравнили результаты мышам, чьи тромбоцитов серотонина фармакологически истощены долгосрочной перспективе ингибитор приложение избирательного обратного захвата серотонина флуоксетин 7. Мы также исследовали лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия после острого лечение флуоксетином 8.
В этом протоколе мы ориентируемся на прижизненной микроскопии брыжейки вен, потому что эта модель может быть выполнена быстро, и позволяет действительные измерения лейкоцитов-эндотелиальной и тромбоцитов лейкоцитов взаимодействий. Это гораздо более сложным и трудоемким в прижизненной микроскопии других органов, таких как кости, печени, кожи или мышц кремастер. Режимл описано здесь идеально подходит для воспроизводимого оценки воспалительного взаимодействия клетка-клетка после challengeing его с воспалительным стимулом, таким как внутрибрюшинной инъекции ЛПС.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом мы расскажем подготовку и исполнение прижизненной микроскопии брыжейки вен мышей в естественных условиях. Этот метод дает нам возможность наблюдать лейкоцитов-эндотелиальной и тромбоцитов эндотелиальных взаимодействий 11 непосредственно в живом организме.
<p class="j…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DU 1190/3-1).
Materials
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
References
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).
- Atherton, A., Born, G. V. Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls. The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).
- Duerschmied, D., et al. Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17). Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).
- Chauhan, A. K., et al. ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation. The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).
- Duerschmied, D., et al. Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice. Blood. 121, 1008-1015 (2013).
- Herr, N., et al. Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice. PloS one. 9, e88316 (2014).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab animal. 37, 26-32 (2008).
- Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. Immune functions of platelets. Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure. European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).
- Sarma, J., et al. Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes. Circulation. 105, 2166-2171 (2002).
- Sumagin, R., Sarelius, I. H. TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).
