القوارض الدماغ Microinjection لدراسة ركائز الجزيئي للسلوك الدوافع
Summary
Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.
Abstract
Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.
Introduction
Rodents and humans respond in remarkably similar ways to behaviorally relevant stimuli1-3. This suggests that rodents are appropriate subjects for elucidating the molecular substrates of behavior and complex psychiatric conditions4. Understanding the molecular substrates of complex behavioral processes, such as motivation, frequently requires brain microinjection. Both the brain microinjection technique and a primary motivation assay will be presented here. Rats will be used as subjects, but these procedures can readily be adapted to well-handled mice. Included herein are procedures for the manufacture of the required cannulae, obturators (dummy cannulae or stylets), and microinjectors. The method presented is significantly more flexible and more cost-efficient than prefabricated implements. This flexibility will prove valuable when optimizing conditions. Importantly, because the microinjection procedure can be used to test a myriad of hypotheses; the techniques presented here should be broadly applicable. For example, receptor ligands can be microinjected to understand neurochemistry3,5,6; cell-permeable peptides and small-molecules can be microinjected to understand intracellular signaling pathways7-10; toxins, ion channel blockers, or antagonist cocktails can be microinjected to understand circuitry1,11,12.
While the generic protocol presented here can be readily adapted by the user for their particular needs, the procedure is particularly well suited for behavioral assays since microinjection occurs in awake rodents that are only under mild hand restraint. No anesthesia or special restraints are required. This is possible because the brain itself lacks pain sensation. However, if anesthesia is not used, microinjection must occur through cannulae that were previously stereotaxically implanted. This is because nociceptors are present on the scalp, meninges,13 which are the membranes surrounding the brain, and the periosteum,14 which is the membrane covering the skull. It should be noted that microinjection under anesthesia is sometimes desirable. One example is when the virus is being injected, and one may wish to inject virus directly through either stainless steal needles15 or glass pipettes because this can reduce tissue damage and improve transduction efficiency.16,17 The microinjectors described below can be modified for this purpose and suggestions on how to do this can be found in the Discussion. Because other JoVE articles have demonstrated stereotaxic brain cannula implantation,18-20 these procedures will not be covered here.
We present these microinjection procedures together with an assay that quantifies motivation. Several rodent models of motivated behavior are currently in use, such as the runway box and barrier scaling. Here, we describe how to use an operant progressive ratio schedule of reinforcement to quantify motivation where operant responding is being maintained by a reinforcer. Responding on the progressive ratio is responsive to reinforcer magnitude.21,22 Accordingly, this assay is routinely used as a proxy for motivation and/or reinforcing efficacy. 21,23-30 Because several excellent reviews have covered this topic in detail,21,24 we will focus mainly on practical concerns.
Protocol
Representative Results
Discussion
الإجراء المقدمة هنا هو وسيلة فعالة لتصنيع حقنة عادية microinjection وmicroinjectors التي من شأنها أن تساعد في توضيح ركائز الجزيئية للسلوك دوافع. يوفر هذا الأسلوب عدة مزايا. أولا، من خلال تصنيع يزرع وmicroinjectors الخاصة واحد، والمعلمات التجريبية رواية يمكن أن يكون الأمثل بسرعة، أي واحدة لا تحتاج إلى الانتظار لمكونات العرف للوصول. ثانيا، نظرا لقطرها صغير من قنية، والمزيد من حقنة عادية يمكن زرعها في وقت واحد. هذا تقصير الوقت الجراحية المطلوبة، التي يمكن أن تحسن البقاء على قيد الحياة، ويسمح أيضا يزرع متعددة لكل حيوان. ثالثا، البرمجيات المستخدمة للتحكم في غرف استثابي يستوعب بسهولة جداول نسبة التقدمية منذ نسبة نموذج ثابت يمكن تحويلها بسرعة إلى نسبة التدريجي نموذج ببساطة عن طريق تطبيق قائمة المعلمة انتقال الحدث الذي يحتوي على جدول التعزيز المطلوب.
أن تكونمفيدة على نطاق واسع، وعرضت إجراء microinjection العامة التي يجب أن تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع لMicroinjection من ما يقرب من أي كاشف المتاحة حاليا. وبالتالي، فإننا نتوقع أن هذه التقنية سوف تستمر في أن تكون ذات فائدة عالية مماثلة في المستقبل مع تعديلات طفيفة. عن طريق تغيير سوى عدد قليل من المتغيرات، وهذا النهج يمكن تطبيقها على عدد كبير من المواد الكيميائية. المعلمات التي من شأنها أن الأكثر شيوعا معالجته تشمل طول أن يبرز على microinjector من قنية، وحجم الحقن، ومعدل الحقن. على سبيل المثال، يمكن للمرء تريد حاقن لزيادة تبرز من طرف قنية لتجنب ندبة الدبقية التي تشكل عادة حوالي يزرع المزمنة. بالإضافة إلى ذلك، قد ترغب احدة لحقن حجم أكبر. لإبر دقيقة جدا الفيروس الجسم المخطط، وعادة ما تستخدم لحجم 1 ميكرولتر ويتم حقن هذا الحجم عادة على مدى فترة أطول من الزمن (في كثير من الأحيان 7-10 دقيقة بالإضافة إلى 3-10 دقيقة إضافية الوقت نشرها) مقارنة بما كان عليه استخدامد للمواد الدوائية (عادة 0،3-0،5 ميكرولتر أكثر من 2-3 دقيقة زائد 1-3 دقيقة وقت الانتشار إضافية). يجب على المستخدم أن تتشاور مع الأدب و / أو تجريبيا تحديد المعايير الأنسب لاحتياجاتهم. بغض النظر، فإن نجاح هذا الإجراء يعتمد بشكل حاسم على 4 المتغيرات: 1) طول قنية، 2) طول microinjector، 3) نوعية نمط الرش microinjector، و4) سلامة النظام قبل الحقن. لأن موقع microinjection يعتمد على عمق يبرز في microinjector من قنية، لا بد من أن كلا من حقنة عادية (الخطوة 1.2.8) وطول microinjector (آخر الانحناء، الخطوة 2.2.1) وكلاهما يعرف على وجه التحديد وموحدة بين جميع المواد الدراسية . هذا يمكن بسهولة أن يسيطر عليها بسهولة رفض أي تنفيذ هذا ليس هو طول المطلوب في النهائي إعادة القياس. وعلاوة على ذلك، لا يمكن توقع موقع الحقن في حال حدوثه على الفور تحت قنية دليل. وبالتالي، فإن أي microinjector أن ظبيةق تقم برش طويل، تيار غرامة على اختبار (خطوات 2.4.6) يجب رفضه. ويرتبط حقن الجودة أيضا لسلامة النظام قبل الحقن. إذا بعد الاستغناء عن المياه من حاقن (قبل ملء مع كاشف) لوحظت بقع متعددة على مسح المختبر، ثم يحتاج إلى تسرب لمعالجتها (ملاحظة على الخطوة 2.4.8). وعلاوة على ذلك، إذا كان فقاعة (الخطوة 2.4.9) الذي يفصل الدواء من الماء في أنابيب PE20 ليست واحدة، فقاعة واحدة (بعد ملء microinjector مع كاشف)، ومن ثم انسداد حاقن جزئيا. هذا تسد إما أن يمنع أو يحول الحقن. هذا أيضا يمكن معالجتها بسهولة (ملاحظة على الخطوة 2.4.8).
ينبغي للمرء أن ترغب في microinject في حين أن الحيوان هو في إطار التجسيمي هناك ثلاثة بدائل. أولا، يمكن للمرء أن زيادة طول طوق microinjector بحيث يمكن عقد بحزم إلى جانب تتلاعب التجسيمي، وكذلك تمديد بعيدا بما فيه الكفاية للسماح للاتصال PE20 أنابيب. ثانيا، علىه يمكن زرع زمنيا قنية واستخدام microinjector القياسية المعروضة هنا. ثالثا، يمكن للمرء أن استخدام المرسومة، والماصات الزجاج المصقول. 16،17
وجود قيود كبير من الإجراء المقدمة هنا هو أن أفضل أجريت في الفئران التعامل معها بشكل جيد والتي هم على دراية الإجراء. الفئران المستخدمة للبيانات الموضحة في قسم النتائج المطلوبة أي إجراءات معالجة خاصة لنفس محقق التعامل مع الفئران على أساس يومي لأكثر من 2 أشهر. وشملت هذه الملاحظة اليومية والتلاعب في عملية الزرع الجراحي لمدة 2 أسابيع على الأقل. ومع ذلك، الفئران يمكن اعتادوا بسرعة عن طريق عدد من التقنيات التي تستخدم لقبل قبل نبض تثبيط الفحص، التي يمكن أن تتأثر الإجهاد. تم هذه التقنيات التعود الخاصة مفصل بشكل جيد في السابق. 43 وبالإضافة إلى هذه الإجراءات، فإنه من المستحسن أن الفئران أن تعود على الإجراء microinjection حيث يتم استخدام microinjectors تقصير دوحلقة حقن "صورية". خلال هذه الحقن الشام، فمن الأهمية بمكان أن microinjector لا تبرز في الأنسجة من أجل الحد من تلف الأنسجة. وبعبارة أخرى، يجب أن تكون عازمة على microinjector لم يعد من 14 ملم. وهكذا، فإن التعود شامل اللازمة لتنفيذ الأمثل لهذه التقنية يمكن أن ينظر إليه القيد.
ورغم وجود العديد من النماذج السلوكية لقياس الدافع، يتم استخدام نسبة التقدمية عادة لقياس جهد أن هذا الموضوع هو على استعداد لبذل للحصول على معزز. وتدريجيا نسبة نموذج تنتج قدرا تعرف باسم نقطة، والتي غالبا ما تعرف بأنها أقصى عدد من المطابع رافعة في نسبة الانتهاء الماضية؛. أي القصوى الاستجابة التي ولدت معزز 21 ونسبة التقدمية حساسة للمعزز الحجم. على سبيل المثال، أعلى الكوكايين (أو السكروز) جرعات ينتج نقطة توقف ارتفاع وانخفاض الكوكايين (أو السكروز) جرعات تسفر عن breakp أقلoint. 21،22 وبناء على ذلك، توقف هو وكيل تستخدم بشكل روتيني لالدافع و / أو تعزيز الفعالية. 21،23-26 لأن القصد من نقطة هي لتحديد متى يتوقف الحيوان الاستجابة، معلمة هامة من نسبة التقدمية النموذج هو طول الدورة. يمكن أطوال جلسة محدود وضع غطاء زائف على القيم نقطة توقف وهذا يمكن أن تتفاقم كل العلاجات السابقة التي تقلل بشكل غير طبيعي معدل الإدارة الذاتية أو أن التوقف زيادة ما بعد التعزيز. هذا الخلط يمكن التغلب على أي عدد من النهج؛. على سبيل المثال، جلسات العمل التي تنتهي عند حجب الحيوان الاستجابة من قبل بعض متعددة من متوسط الفترة الفاصلة بين ضخ 44 A البديل أكثر تطبق عادة لهذا النهج هو إنهاء جلسات عمل مرة واحدة الاستجابة له تم حجب بعض قيمة محددة تجريبيا، والذي يقام ثابت عبر المواضيع. قدمنا طريقة لتطبيق هذا النهج في الخطوة 4.4.9.11.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MSB is supported by the Alcohol Beverage Medical Research Foundation, a Center for Translational Research Award (UL1 TR000058), the National Institutes for Alcohol Abuse and Alcoholism (P50 AA022537), and startup funds provided by the Virginia Higher Education Equipment Trust Fund and the VCU School of Medicine.
Materials
| Cannula Tubing | Amazon Supply/ Small Parts | HTXX-26T-60 | 26 gauge, Hypotube S/S 316-TW 26GA |
| Obturator | Amazon Supply/ Small Parts | GWXX-0080-30-05 | 33 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN |
| Microinjector Wire | MicroGroup | 33RW 304 | 33 gauge |
| Super Glue | Loctite | 3924AC | Liquid, Non-gel, can be autoclaved |
| Microinjector Plastic Tubing | Becton Dickson | 427406 | PE20 |
| Medium Weight Hemostats | World Precision Instruments | 501241-G | |
| Ruler | Fisher | 09-016 | 150 mm |
| #7 Forceps | Stoelting | 52100-77 | Dumont, Dumostar |
| Rotary Tool | Dremmel | 285 | Two-speeds |
| Cut-off Disc | McMaster Carr | 3602 | 15/16" x 0.025" |
| Microinjection Pump | Harvard Apparatus | PhD 2000 | |
| 1 ul Glass Syringe | Hamilton | 7001KH | Needle Style: 25s/2.75"/3 |
| Cotton Tipped Applicator | Fisher | 23-400-101 | |
| Lab Wipes | Kimwipes | 34133 | |
| Operant Software | Coulbourn | Graphic State | |
| Operant Chambers | Coulborun | Habitest |
References
- Koob, G. F., Volkow, N. D. Neurocircuitry of addiction. Neuropsychopharmacology. 35 (1), 217-238 (2010).
- Kalivas, P. W., Peters, J., Knackstedt, L. Animal models and brain circuits in drug addiction. Mol Interv. 6 (6), 339-344 (2006).
- Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology (Berl). 229 (3), 453-476 (2013).
- Connor, E. C., Chapman, K., Butler, P., Mead, A. N. The predictive validity of the rat self-administration model for abuse liability). Neurosci Biobehav Rev. 35 (3), 912-938 (2011).
- Watson, D. J., et al. Selective blockade of dopamine D3 receptors enhances while D2 receptor antagonism impairs social novelty discrimination and novel object recognition in rats: a key role for the prefrontal cortex. Neuropsychopharmacology. 37 (3), 770-786 (2012).
- Takahashi, A., Shimamoto, A., Boyson, C. O., DeBold, J. F., Miczek, K. A. GABA(B) receptor modulation of serotonin neurons in the dorsal raphe nucleus and escalation of aggression in mice. J Neurosci. 30 (35), 11771-11780 (2010).
- Spencer, R. C., Klein, R. M., Berridge, C. W. Psychostimulants act within the prefrontal cortex to improve cognitive function. Biol Psychiatry. 72 (3), 221-227 (2012).
- Bowers, M. S., et al. Activator of G protein signaling 3: a gatekeeper of cocaine sensitization and drug seeking. Neuron. 42 (2), 269-281 (2004).
- Abudara, V., et al. The connexin43 mimetic peptide Gap19 inhibits hemichannels without altering gap junctional communication in astrocytes. Front Cell Neurosci. 8, 306 (2014).
- Cahill, E., et al. D1R/GluN1 complexes in the striatum integrate dopamine and glutamate signalling to control synaptic plasticity and cocaine-induced responses. Mol Psychiatry. 19 (12), 1295-1304 (2014).
- McFarland, K., Kalivas, P. W. The circuitry mediating cocaine-induced reinstatement of drug-seeking behavior. J Neurosci. 21 (21), 8655-8663 (2001).
- Fuchs, R. A., Branham, R. K., See, R. E. Different neural substrates mediate cocaine seeking after abstinence versus extinction training: a critical role for the dorsolateral caudate-putamen. J Neurosci. 26 (13), 3584-3588 (2006).
- Ebersberger, A. Physiology of meningeal innervation: aspects and consequences of chemosensitivity of meningeal nociceptors. Microsc Res Tech. 53 (2), 138-146 (2001).
- Netter, F. H. . Musculoskeletal System Part I: Anatomy; Physiology, and Metabolic Disorders. 8, (1987).
- Ferguson, S. M., Eskenazi, D., Ishikawa, M., Wanat, M. J., Phillips, P. E., Dong, Y., Roth, B. L., Neumaier, J. F. Transient neuronal inhibition reveals opposing roles of indirect and direct pathways in sensitization. Nat Neurosci. 14 (1), 22-24 (2011).
- Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quinones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. J Vis Exp. (46), (2010).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), (2013).
- Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. J Vis Exp. (67), (2012).
- Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. J Vis Exp. (59), e3528 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J Vis Exp. (20), e880 (2008).
- Richardson, N. R., Roberts, D. C. Progressive ratio schedules in drug self-administration studies in rats: a method to evaluate reinforcing efficacy. J Neurosci Methods. 66 (1), 1-11 (1996).
- Cheeta, S., Brooks, S., Willner, P. Effects of reinforcer sweetness and the D2/D3 antagonist raclopride on progressive ratio operant performance. Behav Pharmacol. 6 (2), 127-132 (1995).
- Roberts, D. C., Morgan, D., Liu, Y. How to make a rat addicted to cocaine. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 31 (8), 1614-1624 (2007).
- Arnold, J. M., Roberts, D. C. A critique of fixed and progressive ratio schedules used to examine the neural substrates of drug reinforcement. Pharmacol Biochem Behav. 57, 441-447 (1997).
- Hodos, W. Progressive ratio as a measure of reward strength. Science. 134 (3483), 943-944 (1961).
- Depoortere, R. Y., Li, D. H., Lane, J. D., Emmett-Oglesby, M. W. Parameters of self-administration of cocaine in rats under a progressive-ratio schedule. Pharmacol Biochem Behav. 45 (3), 539-548 (1993).
- Bowers, M. S., et al. Nucleus accumbens AGS3 expression drives ethanol seeking through G betagamma. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12533-12538 (2008).
- Bull, C., et al. Rat Nucleus Accumbens Core Astrocytes Modulate Reward and the Motivation to Self-Administer Ethanol after Abstinence. Neuropsychopharmacology. 39 (12), 2835-2845 (2014).
- Hopf, F. W., Chang, S. J., Sparta, D. R., Bowers, M. S., Bonci, A. Motivation for alcohol becomes resistant to quinine adulteration after 3 to 4 months of intermittent alcohol self-administration. Alcohol Clin Exp Res. 34 (9), 1565-1573 (2010).
- Hopf, F. W., et al. Reduced nucleus accumbens SK channel activity enhances alcohol seeking during abstinence. Neuron. 65 (5), 682-694 (2010).
- Salerni, C. M. . Engineering Adhesives for Repeated Sterilization. , (2015).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J Microsc. 147 (Pt 3), 229-263 (1987).
- Mastakov, M. Y., Baer, K., Xu, R., Fitzsimons, H., During, M. J. Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain. Mol Ther. 3 (2), 225-232 (2001).
- Burger, C., Nguyen, F. N., Deng, J., Mandel, R. J. Systemic mannitol-induced hyperosmolality amplifies rAAV2-mediated striatal transduction to a greater extent than local co-infusion. Mol Ther. 11 (2), 327-331 (2005).
- Agulhon, C., et al. Modulation of the autonomic nervous system by acute glial cell Gq-GPCR activation in vivo. J Physiol. 591 (22), 5599-5609 (2013).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. PNAS. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Cruikshank, S. J., et al. Potent block of Cx36 and Cx50 gap junction channels by mefloquine. PNAS. 101 (33), 12364-12369 (2004).
- Miguel-Hidalgo, J., Shoyama, Y., Wanzo, V. Infusion of gliotoxins or a gap junction blocker in the prelimbic cortex increases alcohol preference in Wistar rats. J Psychopharmacol. 23 (5), 550-557 (2008).
- Bowers, M. S., Lake, R. W., Rubinchik, S., Dong, J. Y., Kalivas, P. W. Elucidation of Homer 1a function in the nucleus accumbens using adenovirus gene transfer technology. Ann N Y Acad Sci. 1003, 419-421 (2003).
- Mackler, S. A., et al. NAC-1 is a brain POZ/BTB protein that can prevent cocaine-induced sensitization in the rat. J Neurosci. 20 (16), 6210-6217 (2000).
- Geyer, M. A., Swerdlow, N. R. Measurement of startle response, prepulse inhibition, and habituation. Curr Protoc Neurosci. 8, Unit 8.7 (2001).
- Bedford, J. A., Bailey, L. P., Wilson, M. C. Cocaine reinforced progressive ratio performance in the rhesus monkey. Pharmacol Biochem Behav. 9 (5), 631-638 (1978).
