TRAP-الصليب الأحمر، وترجمة ريبوسوم الانجذاب تنقية من بالسكان خلية نادر<em> ذبابة الفاكهة</em> الأجنة
Summary
Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture cell-type-specific translation of mRNA. Here we report the first TRAP protocol dedicated to isolation of mRNA in rare cell populations of Drosophila embryos.
Abstract
Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given point in time. The protocol dubbed Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) is able to capture this mRNA translation process in a cell-type-specific manner. Based on the affinity purification of polysomes carrying a tagged ribosomal subunit, TRAP can be applied to translatome analyses in individual cells, making it possible to compare cell types during the course of developmental processes or to track disease development progress and the impact of potential therapies at molecular level. Here we report an optimized version of the TRAP protocol, called TRAP-rc (rare cells), dedicated to identifying engaged-in-translation RNAs from rare cell populations. TRAP-rc was validated using the Gal4/UAS targeting system in a restricted population of muscle cells in Drosophila embryos. This novel protocol allows the recovery of cell-type-specific RNA in sufficient quantities for global gene expression analytics such as microarrays or RNA-seq. The robustness of the protocol and the large collections of Gal4 drivers make TRAP-rc a highly versatile approach with potential applications in cell-specific genome-wide studies.
Introduction
فهم كيفية الخلايا تكتسب خصائص محددة خلال التنمية أمر بالغ الأهمية من أجل إدراك تعقيد الأجهزة وتطورها المحتمل تجاه الحالات المرضية. هناك دفعة كبيرة لبحث فك شبكات الجينات التنظيمية تشكل أساس مواصفات الخلايا والتمايز التي كتبها unrevealing ملامح التعبير الجيني العالمية، ووضع ملزمة بول الثاني، شغل النسخ عامل في تسلسل التنظيمية أو التعديلات بعد متعدية من الهستونات.
لتقييم التعبير الجيني في ميكروأرس على الصعيد العالمي وتستخدم نهج RNA وما يليها. ميكروأرس تسمح للكشف عن وفرة مرنا، في حين RNA وما يليها هو أفضل موجهة لإعلام على أنواع مختلفة من الرنا بما في ذلك الترميز وغير المرمزة noncoding الموجودة الرنا مثل microRNAs، lncRNAs أو snRNAs. ومع ذلك، يمكن لهذه التقنيات لا تفرق نسخه بنشاط، حالة استقرار مرنا، بنشاط-ترجمة مرنا، ومرنا دخول عملية التحلل. قياس ثابت-شارع تناولوا مستويات مرنا أنه من المعروف أن تقدير ضعف تكوين بروتيوم 1-3. في العكس من ذلك، تحديد بنشاط-ترجمة مرنا يعطي صورة أكثر دقة لإنتاج البروتين.
ومع ذلك، فقد تم أساسا أدت الدراسات transcriptomic على مستوى كامل الحي من خلال مقارنة بالربح أو الخسارة من وظيفة عامل محدد لمن النوع البري شرط 4-7 أو على تشريح الأنسجة، مما يجعل ملامح التعبير الجيني يصعب تفسيرها. التطورات الحديثة في أدوات استهداف الخلايا، وتنقية تقارب وتحسن حساسية تسمح الآن لإجراء تحليلات واسعة الجينوم على السكان خلية أو خلايا صغيرة حتى واحدة في الكائن الحي.
في ذبابة الفاكهة، مجموعات كبيرة من خطوط المعدلة وراثيا تمكن محددة تستهدف الزمني والمكاني من الأنسجة المختلفة والفئات السكانية الخلية عن طريق نظام GAL4 / UAS 10/08 العائد الكمي أكثر دقة من الآليات الجزيئية المطلوبة لوظيفة الخلية.
<p clالحمار = "jove_content"> ومن بين المناهج المطورة حديثا polysome وقد وصفت التنميط التي كتبها تجزئة كوسيلة لالتقاط بنشاط-ترجمة RNA 11. هذا الأسلوب يعتمد على السكروز التدرج الطرد المركزي يسمح اختيار جزء polysome وتحديد مرنا ترجمت على نطاق الجينوم عند تحليلها مع ميكروأرس أو التسلسل عميق. ويمكن أن يقترن Polysome العزلة مع نوكلياز الهضم لتحديد آثار أقدام الريباسي المقابلة لشظايا الحمض النووي الريبي التي يحميها ريبوسوم خلال عملية الترجمة 12. البصمة الريباسي يزيد من دقة التحديد الكمي للترجمة RNA وقرار RNA على مستوى تسلسل وتحديد المواقع الريبوسوم، يجعل من الممكن لقياس معدل الترجمة. إلا أنه حتى اليوم لم يتم تطبيقه على عزل خلية محددة من translatomes، ويرجع ذلك أساسا إلى انخفاض قوي في الغلة RNA التي تم الحصول عليها في نهاية عملية البصمة الريبوسوم. وبالنظر إلى أن اختيار حجم RNA قد تولد المحتملين كاذبة صositives من RNPs المختلفة التي يمكن أيضا حماية RNA بطريقة مماثلة، وهناك حاجة إلى مزيد من التطورات لتحسين الريباسي البصمة وتكييفها مع النهج خلية محددة.واحد من هذه الأساليب، ودعا وصفت في ترجمة ريبوسوم الانجذاب تنقية (TRAP) في عام 2008 من قبل هيمان وآخرون. وتطبق على عزل translatome من مجموعة فرعية من الخلايا العصبية في الفئران. قبل حاتمة العنونة بروتين الريباسي بطريقة الخلية من نوع معين، polysomes يمكن تنقيته بشكل انتقائي دون خطوة شاقة من التفكك الخلية والفرز. في هذه الحالة، 60S البروتين الريباسي L10a على سطح الريبوسوم كانت المعلمة مع EGFP 13. منذ عام 2008، وقد استخدمت العديد من الدراسات هذه الطريقة في أنواع مختلفة من الفئران 14-19 إلى العاشرة المورق 20،21، 22،23 الزرد ونبات الأرابيدوبسيس thaliana 24. كما تم تكييف طريقة TRAP للنموذج ذبابة الفاكهة وتستخدم لبوريمن mRNAs من الخلايا العصبية 25 و 26 النجمية السنة المالية المحددة من نوع الخلية. تم استخدام ثنائي نظام GAL4 / UAS متعددة للتعبير عن RpL10A GFP الموسومة بطريقة الأنسجة محددة. تم تشريح رؤساء الذباب الكبار لأداء اختيار polysome من الخلايا العصبية (التي تستهدفها عموم العصبي سائق Elav-GAL4) والرنا المعزولة والتسلسل. يتفق عدد كبير من الجينات تنظم يصل إلى أن يعرف أن يتم التعبير عنها في الجهاز العصبي، مشيرا إلى أن النهج خصوصية جيدة ودفع لنا لتكييفه مع السكان الخلية نادرة (أقل من 1٪ من الخلايا) الحاضر في وضع الأجنة ذبابة الفاكهة .
ضمن نموذج ذبابة الفاكهة، والمرحلة الجنينية هي نموذج للاختيار لدراسة العمليات التنموية، والجهات الفاعلة الجزيئية والحركات التخلق يتم حفظها التطورية. وقد تم تنفيذ النهج transcriptomic الوحيدة الأنسجة محددة التي أجريت حتى الآن في هذا النموذج باستخدام خلايا أو حتى النوويةrting وكانت فقط قادرة على دراسة Transcriptome على الحالة المستقرة 27-31، وخلق الحاجة إلى طرق مخصصة لالأنسجة / خلية محددة translatome التنميط في الجنين الطاير. نحن هنا تقرير أول بروتوكول TRAP مخصصة لأجنة ذبابة الفاكهة. مع هذا الأسلوب، وتشارك في الترجمة مرنا في السكان الخلية محدودة جدا من حوالي 100 خلايا العضلات في جنين تم عزل بنجاح مع جودة عالية وخصوصية. يتم استخدام GAL4 / نظام UAS ثنائي لدفع التعبير عن RpL10A الموسومة GFP في حيوانية من العضلات دون أي سمية، لا الظواهر الواضحة أو تأخر في النمو كما هو موضح سابقا 25. أجنة ذبابة الفاكهة تمتلك 30 العضلات في hemisegment التي من شأنها أن تؤدي إلى الجهاز العضلي من اليرقة. باستخدام المنطقة التنظيمية التي اكتشفت في المنطقة المجاورة للهوية الجينات ترهل، 6 من 30 العضلات متعددة الأنوية هي المستهدفة. في هذا الاختبار، وثبتوا ريبوسوم على مرنا باستخدام استطالة الترجمةالمانع سيكلوهيكسيميد. ثم يتم استخدام مقتطفات عصاري خلوي لتنقية تقارب مع حبات مغناطيسية المغلفة الأجسام المضادة GFP. تم التحقق نوعية RNA تنقيته باستخدام bioanalyzer. وقد استخدم الكمي عكس النسخ PCR (RT-QPCR) لتحديد خصوصية وحساسية مرنا العزلة وأثبتت أن لدينا بروتوكول الأمثل هو كفاءة عالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه الورقة المعدلة الترجمة ريبوسوم الانجذاب تنقية البروتوكول (يطلق عليها اسم "TRAP-الصليب الأحمر") مخصصة لدراسة السكان الخلية نادرة في الأجنة ذبابة الفاكهة. يتم توفير معلومات عن الخطوات الرئيسية لعزل ناجحة من الحمض النووي الريبي معين مع تحقيق عائد مناسب لميكروأري أو تحليل الحمض النووي الريبي وما يليها، أي 1) كمية من المواد البيولوجية المطلوبة وإجراء الأمثل للتحلل الجنين واستخراج polysome. 2) الخرز / نسب للمناعي الأمثل المحللة الأجسام المضادة ل؛ 3) خطوات السماح الحد من الخلفية بما في ذلك غسل تكوين عازلة وذلك لتشغيل تجارب TRAP RC مع خصوصية عالية وحساسية.
هذا البروتوكول غلة البيانات استنساخه مما يجعل تطبيقها بسهولة إلى أي نوع من أنواع الخلايا الأخرى. هذا الأسلوب يجعل من الممكن لتحليل الفرق التعبير الجيني على مستوى مرنا بنشاط-ترجمة وبالتالي تمهيد الطريق لفهم البروتين التعبير في المواصفات IFIC نوع من الخلايا في إطار زمني محدد. ومع ذلك نلاحظ أن وفرة البروتين سيعتمد على معدل عمليات الترجمة والتدهور. العيوب الرئيسية للطريقة TRAP هو عدم قدرتها على قياس محتوى البروتين بطريقة كمية دقيقة أو للكشف عن تعديل آخر متعدية. يمكن تحسين الكمي عن طريق قياس كثافة الريبوسوم على طول الجسم مرنا، وعند القيام بذلك، بطريقة الخلية من نوع معين جعل TRAP جنبا إلى جنب مع الريبوسوم البصمة أداة قوية جدا. في ورقة حديثة 34، تم إجراء هذا المزيج في الجنينية الكلى 293 الخلايا البشرية. ونشرت الكتاب البصمة نوكلياز تليها تنقية تقارب من شكل المعقدة البيروكسيديز محرض من RpL10A باستخدام الخرز streptavidin. هذا هو دليل على مبدأ أنه من الممكن لأداء البصمة الريبوسوم في الحي كله في حين استهدفت نوع خلية معينة، وتقييد يجري كمية المواد البيولوجية اللازمة لهذا الغرض.
"> إجراء التجارب TRAP بالتوازي مع التحليلات transcriptomic العالمية سوف تجعل من الممكن لتتبع النسب بين حديثا كتب وactively- ترجمة RNA، وهذا سيكون بالمعلومات عميق لآليات ما بعد النسخي المحتملة التي تجري في سياقات تنموية محددة أو السكان خلية معينة microRNAs بقلم على سبيل المثال.في الختام، TRAP يعد طريقة فعالة للغاية ومحددة وحساسة لتحديد الرنا بد أن بنشاط-ترجمة ريبوسوم بطريقة خلية محددة. هذه الطريقة يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة واسعة من الكائنات الحية وأنواع الأنسجة. وكان محسن بروتوكول TRAP-الصليب الأحمر الجديد هو موضح هنا للالسكان الخلية نادرة (أقل من 1٪ من إجمالي عدد الخلايا) وكمية من المواد النهائية كافية للتحليلات لاحقة على مستوى كامل الجينوم.
A الحد الممكن من هذا الأسلوب هو شرط دافعا قويا لإنتاج ريبوسوم الموسومة في كمية كافية لتراكبمؤسسة التدريب الأوروبية بأخرى لازال المحلية في نوع من الخلايا المستهدفة. في دراسة حديثة 25، قدرت الكتاب إلى 10-30٪ نسبة الموسومة مقابل ريبوسوم لازال.
للتغلب على هذه المشكلة زيادة UAS-RpL10A-EGFP عدد نسخة من شأنه أن يحسن بشكل كبير هذا التوازن. بدلا من ذلك، إضافة إلى خلفية وراثية وصف التحوير UAS-GAL4 وتضخيم إنتاج البروتين GAL4 وغير مباشرة زيادة التعبير عن RpL10A-EGFP. وهذا ينبغي أن تحبذ عقد الإشغال أفضل للريبوسوم الموسومة على مرنا.
لاحظ أن هذا نهج فعال بالفعل ويمكن إجراء أكثر قوة وتكييف الأساليب المكملة لجلب المزيد من الجانب الكمي أو لاكتشاف وكشف الآليات الجزيئية التي تعد ضرورية للسيطرة على التعبير الجيني.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Nicolas Allegre, Maud Peyny and Jean-Philippe Da Ponte for their excellent technical assistance. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), the INSERM starting grant, ANR ID-CELL-SPE grant, Equipe FRM and the AFM 15845 grant.
Materials
| HEPES | Sigma | H4034-1006 | |
| 1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850306P | |
| Glycogen | thermo scientific | R0561 | |
| Purified BSA 100X | Biolabs | B9001 | |
| Yeast tRNA | Sigma | R5636 | |
| Super RNase In | Ambion | AM2694 | |
| Antibody GFP clone N86/38 | UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Antibodies Incorporated | 75-132 | |
| Nonidet P40 | Roche | 11754595001 | |
| Precellys 24 Lysis homogenisation | Bertin Technology | ||
| Nuclease free water | Nalgene | ||
| Dynabeads ProteinG | Invitrogen | 10004D | |
| Potassium chloride (KCl) | Applied Biosystem | AM96406 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Applied Biosystem | AM95306 | |
| Cellulose waddin unbleached | VWR | 115-2597 | |
| Sieves 112, 355, 710 um | Retsch | ||
| TRiZol | Invitrogen | 15596-018 | |
| MagRack 6 | GE HealthCare | 28948964 | |
| Low binding filter tips | ClearLine | ||
| Rnase free tube 1,5 mL | ClearLine | 390689DD | |
| Tween 20 | Fischer Bioreagent | BP337-500 | |
| Cycloheximide | Sigma | C1985 | |
| Protease inhibitor tablets, Mini-Complete, EDTA-free | Roche | 11836170001 |
References
- Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Molecular bioSystems. 5, 1512-1526 (2009).
- Maier, T., Guell, M., Serrano, L. Correlation of mRNA and protein in complex biological samples. FEBS letters. 583, 3966-3973 (2009).
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (1038).
- Junion, G., et al. Genome-wide view of cell fate specification: ladybird acts at multiple levels during diversification of muscle and heart precursors. Genes. 21, 3163-3180 (2007).
- Jakobsen, J. S., et al. Temporal ChIP-on-chip reveals Biniou as a universal regulator of the visceral muscle transcriptional network. Genes. 21, 2448-2460 (2007).
- Cunha, P. M., et al. Combinatorial binding leads to diverse regulatory responses: Lmd is a tissue-specific modulator of Mef2 activity. PLoS genetics. 6, e1001014 (2010).
- Sandmann, T., et al. A core transcriptional network for early mesoderm development in Drosophila melanogaster. Genes, & development. 21, 436-449 (2007).
- Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512, 91-95 (2014).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 9715-9720 (2008).
- Gallo, S. M., et al. REDfly v3.0: toward a comprehensive database of transcriptional regulatory elements in Drosophila. Nucleic acids research. 39, D118-D123 (2011).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7, 1534-1550 (2012).
- Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
- Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135, 749-762 (2008).
- Dougherty, J. D., Schmidt, E. F., Nakajima, M., Heintz, N. Analytical approaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched in specific cells. Nucleic acids research. 38, 4218-4230 (1093).
- Fomchenko, E. I., et al. Recruited cells can become transformed and overtake PDGF-induced murine gliomas in vivo during tumor progression. PloS one. 6, e20605 (2011).
- Helmy, K., et al. Identification of global alteration of translational regulation glioma in vivo. PloS one. 7, e46965 (2012).
- Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
- Drane, L., Ainsley, J. A., Mayford, M. R., Reijmers, L. G. A transgenic mouse line for collecting ribosome-bound mRNA using the tetracycline transactivator system. Frontiers in molecular neuroscience. 7, 82 (2014).
- Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
- Watson, F. L., et al. Cell type-specific translational profiling in the Xenopus laevis retina. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 241, 1960-1972 (2012).
- Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 13416-13421 (2013).
- Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
- Jiao, Y., Meyerowitz, E. M. Cell-type specific analysis of translating RNAs in developing flowers reveals new levels of control. Molecular systems biology. 6, 419 (2010).
- Thomas, A., et al. A versatile method for cell-specific profiling of translated mRNAs in Drosophila. PloS one. 7, e40276 (2012).
- Huang, Y., Ng, F. S., Jackson, F. R. Comparison of Larval and Adult Drosophila Astrocytes Reveals Stage-Specific Gene Expression Profiles. G3. , (2015).
- Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genome Res. 22, 766-777 (2012).
- Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. Cell type-specific genomics of Drosophila neurons. Nucleic acids research. 40, 9691-9704 (2012).
- Dobi, K. C., Halfon, M. S., Baylies, M. K. Whole-genome analysis of muscle founder cells implicates the chromatin regulator Sin3A in muscle identity. Cell reports. 8, 858-870 (2014).
- Salmand, P. A., Iche-Torres, M., Perrin, L. Tissue-specific cell sorting from Drosophila embryos: application to gene expression analysis. Fly. 5, 261-265 (2011).
- Busser, B. W., et al. Molecular mechanism underlying the regulatory specificity of a Drosophila homeodomain protein that specifies myoblast identity. Development. 139, 1164-1174 (2012).
- Rorth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of development. 78, 113-118 (1998).
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218, 348-353 (1982).
- Ingolia, N. T., et al. Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes. Cell reports. 8, 1365-1379 (2014).
