眼刺激试验（EIT）使用重构型人角膜上皮样（RHCE）组织模型眼刺激性化学品危险性鉴定

1.准备RHCE组织治疗 – 0天在收到的商业人的角膜样上皮（RHCE）试剂盒，检查材料进行企业所得税法（ 表2）所需的所有套件组件的完整性（对于包的详细信息请参见标准测定试剂盒组件（ 表1），设备及。在收据的当天，平衡组织（在其24孔运输集装箱）至RT 15分钟。 多少 试剂 条件 资源 描述 截止日期 1 密封24孔板EpiOcular组织 （OCL-200） 2-8℃， MatTek 包含24 TISS细胞培养的UE接入，封装在琼脂糖 72小时 1瓶， 200毫升 EpiOcular分析培养基 （OCL-200-ASY） 2-8℃， MatTek DMEM基础培养基 21天 1瓶， 百毫升 CA ++ Mg ++的-免费Dulbecco's-PBS（DPBS） RT Sigma-Aldrich公司，D5652，或当量。 用于漂洗刀片 1年 4 6孔板 RT 鹘用于试验的协议过程中保持组织 NA 2 12孔板 RT 鹘分析方案期间使用 NA 2 24孔板 RT 鹘用于执行MTT法 NA 1瓶， 0.5毫升醋酸甲酯 （CAS＃79-20-9） RT Sigma-Aldrich公司， 猫＃186325 在测定中用作个人电脑 1个月 表1：标准检测试剂盒组件。 设备/材料 需要： 加湿培养箱（37±1℃，5±1％的CO 2，90±10％湿度） 之前和期间实验孵化组织层流罩在无菌条件下安全工作真空泵（可选） 吸取媒体及解决方案板阅读器光度计（对于96孔板） 读OD 平板振动器精华甲的离子无菌，钝边钳处理组织刀片秒表在该协议的应用程序测试的材料和其他定时的步骤的定时水浴（37±1℃） 温补媒体和MTT溶液研钵和研杵研磨粒状固体容积式移液器（50微升） 的粘性和半固体材料和悬浮液中的应用可调移液器（200微升-2毫升） 液体材料，测定培养基和MTT的应用预消毒吸头（200微升和20微升），猫的Rainin＃HR-200F和HR-20F（或同等学历） 液体材料，测定培养基和MTT的应用广口预消毒吸头（250微升），猫的Rainin＃HR-250WS（或当量alent） 的粘性和半固体材料和悬浮液中的应用 8盎司/220毫升标本容器，猎鹰猫＃3540200（或同等学历） 冲洗组织无菌一次性使用注射器（ 如 1毫升tuberkulin注射器Omnifix-F，贝朗Melsungen的公司，目录号9161406V） 交货〜50毫克的固体材料（可选） 特德佩拉微锅铲/汤匙，特德佩拉公司，猫＃13504（或同等学历，锐匙或骨刮匙， 如蛇牌，编号：FK 623） 交货〜50毫克的固体材料 Ca ++和Mg ++的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（钙++ Mg ++的自由DPBS）：Sigma-Aldrich公司，目录＃D5652（或相当的） 试验过程中冲洗组织无菌去离子水，组织培养级（质量生物或同等学历） <TD>使用数控 96孔平底板，猎鹰（或同等学历） 对于读OD 棉签掉期（无菌） 对于干燥的组织表面（可选） 胶带或封口膜甲臜提取过程中盖板 MTT-100测定试剂盒含有MTT-噻唑蓝四甲基偶氮唑试剂（西格玛＃M-5655）和异丙醇萃取物。 表2：设备和执行的EIT所需材料。 在无菌条件下，打开包含24孔板与RHCE组织的塑料袋，取出的无菌纱布。检查所有组织中的气泡琼脂糖凝胶和插入。下所述插入覆盖物不使用培养物的气泡的插入区域，有缺陷的组织，或组织WHI> 50％ CH完全覆盖液体。 标记6孔板与测试物品或控制代码和曝光时间。等分1.0毫升测定培养基（随试剂盒提供），预热至约37℃，到预标记的6孔板的孔中。 使用无菌镊子除去含有RHCE组织每个插入并放置在插入在标记6孔板。在此步骤期间，除去任何残留的航运琼脂糖粘附到该插入物的外侧上由在无菌滤纸上印迹平缓。释放被困插入下方的气泡。 预孵育RHCE组织在6孔板在标准培养条件下（SCC，湿润气氛用5±1％CO 2的在37±1℃）1小时。 1小时后，更换试验培养基用1.0毫升新鲜试验培养基预热至37℃，并培育了RHCE组织在SCC条件（隔夜= O / N）（16-24小时）。 。ove_title“> 2预处理 – 第1天在O / N培养后，使用适当的移液装置适用20微升的 Ca 2+镁2+的 -贝科的磷酸盐缓冲液（DPBS，提供）。如果DPBS不会在组织蔓延，轻轻拍打上盘插入以保证DPBS弄湿整个组织表面。 孵育RHCE组织在SCC 30±2分钟。 注意：此步骤是必要的组织水合和体内条件来模拟。 3.测试材料曝光程序适用于每一个测试文章，并控制复制RHCE组织（N = 2）。测试品定量给料步骤为液体和固体的不同。局部应用50微升用吸管液体测试文章。的曝光时间的液体是30分钟。适用于50毫克的用一勺夷为平地（校准持有50毫克氯化钠）固体的测试文章。这位前曝光时间为固体为6小时。 注意：液体被定义为流体物质 （如，液体，凝胶，膏霜），可以利用一个移液设备施加。固体定义为非流体物质 （如，粉末，树脂状或蜡状物质），可以不使用移液管施加。 如果试验制品的物理状态是不容易确定，放置与试验制品的小瓶在水浴中进行15分钟（37℃）。遵循EIT协议用于液体为那些液化，在37℃试验制品。 使用正位移移液器尤其是粘性物料。 第一剂量的阴性对照和阳性对照，然后剂量的试验制品。 应用50微升阴性对照组（NC）和阳性对照（PC）使用一个标准的吸管RHCE组织。 NC是无菌的去离子水;在PC是乙酸甲酯（CAS＃79-20-9）。应用NC和PC 30分钟时测试荷兰国际集团的液体测试的文章和6小时测试时，测试固体物品。 4.测试曝光条 – 第1天用于液体检验物品的处理，按照在表3中给出的定时的时间表。离开各试验品的应用程序之间的1分钟的间隔，以确保相等的曝光所有组织中。 后30±2分钟DPBS前处理，局部应用50μl的NC和个人电脑，并且每个液体试验制品局部上使用适当的移液设备的RHCE组织。 申请50微升液体测试品的直接在组织以覆盖上表面上。切断窄点的枪头扩大孔的粘性材料。为非常粘稠的材料，应用测试品，以一计量装置（直径大于组织插入物或塑料图钉的内径稍小的平头筒），颠倒给药ðevice并将其放置到组织上，以使受试制品均匀地接触组织表面。 如果测试的文章不会在组织蔓延，轻轻拍打插入，以确保它涂在整个组织表面。机械散布试验制品（例如，用移液管尖端）不推荐，因为它可能会损坏组织。 孵育组织在SCC 30±2分钟。 为固体试验制品治疗-第1天，按照表 4中给出的定时安排离开各试验品的应用程序之间的2分钟的间隔，以确保相等的曝光所有组织中。 后30±2分钟DPBS前处理，应用局部上使用适当的移液设备的RHCE组织50微升的NC和PC。 为固体试品应用，取出插入物（2例）从井，并将其放置到一个无菌的表面（例如，上午的盖ultiwell板），以避免一个测试品溢出到培养基中。 使用的水平校准勺子，局部应用约50毫克试验制品到组织表面的;确保该组织的表面被完全覆盖试验制品。如果试验制品不横跨组织扩散，轻轻摇动插入件从一侧到另一侧，以确保组织被完全覆盖试验制品。机械散布试验制品（例如，用移液管尖端）不推荐，因为它可能会损坏组织。 如果需要的话，研磨的结晶粉末用研钵和研杵来保证测试品和组织之间更好的接触。 或者，将粉末直接到插入内部的组织培养用1毫升注射器头切断。东西粉末进入注射器当柱塞被拉回，然后通过按压柱塞向下适用。 如果插入的外壁为contaminated 例如 ，通过粉末，用无菌纱布擦拭掉的颗粒。 给药后，返回到组织含有培养基的6孔板和孵化在SCC 6小时±15分钟。 5.漂洗准备一组每次测试第三条干净的烧杯（150毫升容量），并填写他们每个人用100毫升的DPBS。对于每个测试条，利用一组不同的3烧杯中。 在30±2分钟曝光用于液体材料或6小时±15分钟的曝光固体材料的端部，除去并丢弃计量装置，如果它被使用。 通过抓住塑料“衣领”用细镊子的上边缘抬起含有RHCE组织出来的介质的插入。用弯钳，以方便处理和滗析。通过利用镊子的套环保持重复的刀片一起冲洗一次组织2。要小心ñ催产素损伤组织的钳子。 滗从组织表面的测试物品或对照到一个干净的吸收材料（纸毛巾，纱布等 ） 浸镶入DPBS，漩涡的圆周运动在DPBS约2秒的第一烧杯，提起插入物，使得它们大多填充用DPBS，倾倒出液体回烧杯中。在第一烧杯中重复这一过程三次。 冲洗中的每个DPBS三次，第二和第三烧杯刀片以相同的方式。 滗在插入其余到吸收材料的任何液体。旋转刀片以近似45°角（开口端向下）和触摸上唇到吸收材料。 注意：如果这是不可能去除所有可见测试材料制成的，没有进一步的漂洗应做，以避免组织损伤，由于过度处理。 6.后浸泡冲洗后，立即浸入组织在5毫升试验培养基预先加热至RT在预标记的12孔板中。 孵育组织为12±2分钟为液体材料或25±2分钟为浸渍在RT以有利于去除任何残留的测试品的固体材料。 7.后孵化在结束时后浸泡浸泡期间，从组织倒出测定培养基并吸干插入到吸收材料。 转移镶入含1毫升温测定培养基的预标记的6孔板中。 孵育组织为120±15分钟，在SCC用于液体检验材料。 孵育组织18±0.25小时，在SCC固体试验材料。 8. MTT活性测定 – 第1天（协议液体）和第2天（协议固体） 120的后培养后进行MTT法77; 15分钟的液体和，分别为18±0.25小时为固体。 制备1.0毫克/毫升的MTT溶液，将溶液的等分试样0.3毫升到预标记的24孔板的每个孔中。 使用商业试剂盒的MTT（表5）： 使用前2小时，解冻的MTT集中在室温。结合2毫升的MTT浓缩物和8毫升的MTT稀释剂，以产生1.0毫克/毫升的MTT溶液。 储存在4℃的MTT溶液在暗处直到使用。不要存放超过1天MTT溶液。 在邮政孵育结束时，从6孔培养板除去每个插入并轻轻吸干上的吸收性材料。 将镶入24孔板含0.3ml的MTT溶液。释放被困插入下方的气泡。将培养板180±10在SCC分钟。 MTT提取经过180±10分钟孵化的MTT溶液，删除每个插入从24孔板并吸干插入件的底上的吸收性材料。 对于非着色剂液体试验制品（浸没萃取）：转移插入到预标记的24孔平板含有2.0毫升萃取剂溶液（异丙醇）以便它浸没插入。 固体和液体着色剂（非浸没萃取，以避免萃取剂溶液的污染）：转移插入到预标记的6孔平板含有1.0毫升萃取液（异丙醇），以便它不会淹没插入。 注意：执行相同的非浸没提取相应的阴性和阳性对照。 密封该板（例如，与板盖和孔的上边缘之间或带有标准板密封封口膜）。将平板在轨道板振荡器振摇2至3小时，在室温下，以提取的MTT。 另外，执行提取O / N在2-876; C黑暗无晃动。 对于非着色剂液体试验制品（浸没萃取）：在萃取期间结束，倒出从每个液体插入回入井和丢弃含有RHCE组织中的插入。 混合萃取溶液和根据该板配置 （图2）传输2 200微升等份到预标记的96孔板的适当孔中。 固体和液体着色剂（非浸没萃取）：在萃取期间结束，丢弃组织（确保不刺破组织）。 加将1.0ml提取剂溶液的进24孔板含有从组织中提取的溶液的各孔中。混合萃取溶液和根据该板配置 （图2）传输2 200微升等份到预标记的96孔板的适当孔中。 决定T他所提取的样品中的在550和590nm的单一波长的光密度（OD）（应该是一个实验室内一致）上读板器或分光光度计。 的情况下所造成的不溶性固体浑浊提取液，离心之前测量OD（冷却离心机至4℃，以避免蒸发）的解决方案。如果漂洗不删除测试制品（T​​A）和TA干扰MTT减少，额外的控制，必须使用。请参阅详细的SOP以校正MTT还原16。 万一的TA被示出具有，或使之显色可与MTT测量交互，附加的测试必须被执行以确定颜色的结合到量，并随后从组织中提取。请参阅详细的SOP以校正彩色试验制品16。 9.计算为组织的生存力试验（表6和图3）＆＃160; 通用计算计算空白对照孔（OD座）每个实验的平均OD值。 来自相同实验（座校正数据）的每个OD值减去OD座。 计算这两个等分试样的每个组织（=校正OD）的平均值。 计算出每对每个对照和测试条相对于平均阴性对照（100％对照）两个复制组织的百分存活率。 存活率（％）= [校正的OD治疗组织/校正OD阴性对照]×100％ 计算存活率（两次重复的组织之间的存活率差别）的差别。 计算平均值测试制品存活率（TA生存力），并根据该预测模型分类测试制品。 10.预测模型（图3） 如果TA处理的组织生存能力> 60.0相对于NC处理的组织viability，标记检品为无刺激性（NI）（GHS无类别）。 如果TA处理的组织的生存力是≤60.0相对于数控处理的组织活力，标号测试品为刺激物（Ⅰ）（GHS类别1和2）。 注：EIT测试结果都算合格，如果： 企业所得税NC OD> 0.8和<2.5; 的EIT的PC组织活力（％，相对于北卡罗莱纳州）是≤50.0％; 两个复制组织（北卡罗莱纳州，PC和测试物品）之间的差<20.0％。