복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

처리를위한 RHCE 조직 1. 준비 – 일 0 상업 인간의 각막과 같은 상피 (RHCE) 키트를 수신하면, 온. EIT 분석 (표 2)를 수행하는 데 필요한 모든 키트 무결성 (키트 자세한 내용은 구성 요소 참조 표준 분석 키트 구성 요소 (표 1)과 장비 및 재료를 확인 영수증의 날, 15 분 동안 실온 (그것의 24 웰 선적 컨테이너) 조직을 평형. 양 시약 조건 출처 기술 유통 기간 1 EpiOcular 조직의 봉인 된 24 웰 플레이트 (OCL-200) 2-8 ° C 매텍 24, 담배 마는를 포함세포 배양의 단말은 아가 로스에 패키지를 삽입 72 시간 1 병, 200 ml의 EpiOcular 분석 중간 (OCL-200-ASY) 2-8 ° C 매텍 DMEM 기반 매체 이십일일 1 병, 100 ㎖ 마그네슘 + + – 무료 Dulbecco's-PBS (DPBS를) ++ ca를 RT 알드리치, D5652, 또는 당량. 삽입 세척에 사용 일년 4 6 웰 플레이트 RT 매 분석 프로토콜 동안 조직을 유지하는 데 사용 NA (2) 12 웰 플레이트 RT 매 분석 프로토콜 동안 사용 NA (2) 24 웰 플레이트 RT 매 MTT 분석을 수행하는 데 사용 NA 1 병, 0.5 ml의 메틸 아세테이트 (CAS 번호 79-20-9) RT 알드리치, 고양이 # 186325 분석에서 PC로 사용 1 개월 표 1 : 표준 분석 키트 구성 요소. 장비 / 재료 에 필요한 : 가습 인큐베이터 (37 ± 1 ° C, 5 ± 1 % CO 2, 90 ± 10 % 습도) 이전과 분석 기간 동안 배양 조직 층류 후드 멸균 조건에서 안전 작업 진공 펌프 (선택 사항) 매체 및 솔루션 흡입 플레이트 리더 광도계 (96 웰 플레이트) 읽기 OD 플레이트 쉐이커 추출물포르 마잔의 이온 살균, 무딘 칼날 집게 조직 삽입 처리 – 시계를 중지 프로토콜의 시험 자료 및 기타 시간 제한 단계의 적용시기 수조 (37 ± 1 ° C) 온난화 미디어와 MTT 솔루션 박격포와 유 봉 세분화 된 고체를 연삭 긍정적 인 변위 피펫 (50 μL) 점성 및 반 고체 물질 및 현탁액의 응용 프로그램 조정 피펫 (200 μL-2 ㎖) 액체 재료 분석 배지와 MTT인가 사전 멸균 팁 (200 μL, 20 μL), RAININ 고양이 # 1 HR-200F와 HR-20F (또는 동급) 액체 재료 분석 배지와 MTT인가 와이드 오리피스 미리 멸균 팁 (250 μL), RAININ 고양이 # 1 HR-250WS (또는 당량alent) 점성 및 반 고체 물질 및 현탁액의 응용 프로그램 8온스 / 220 ml의 용기 표본, 팔콘 고양이 # 3540200 (또는 동급) 조직을 세척 멸균 일회용 주사기 (예 : 주사기 Omnifix-F, B. 브라운 Melsungen AG, 고양이 tuberkulin 1 ml의. 제 9161406V) ~ 50 mg의 고체 물질의 공급 (옵션) 테드 펠라 마이크로 주걱 / 숟가락, 테드 펠라 주식, 고양이 # 13504 (또는 이에 상응하는, 날카로운 숟가락 또는 뼈 큐렛, 예를 들어 AESCULAP, 번호 : FK 623) ~ 50 mg의 고체 자재의 납품 칼슘 ++ 및 마그네슘 ++ 무료 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (칼슘 + 마그네슘 + + 자유 DPBS) : 시그마 – 알드리치, 고양이 # 1 D5652 (또는 동급) 분석 기간 동안 세척 조직 무균 탈 이온수, 조직 배양 등급 (품질 생물학적 또는 동급) <TD> NC으로 사용 96 웰 평평한 바닥 판, 팔콘 (또는 동급) 외경을 읽기위한 코튼 팁 스왑 (멸균) 조직 표면을 건조 (선택적) 미국 접착 테이프 또는 파라 필름 포르 마잔 추출시 플레이트를 커버 MTT-100 분석 키트 MTT-티아 졸릴 블루 테트라 졸륨 브로마이드 시약 (시그마 # M-5655) 및 이소프로판올 추출물이 포함되어 있습니다. 표 2 : 장비와 EIT를 수행하는 데 필요한 재료. 무균 조건 하에서, RHCE 조직과 24 웰 플레이트를 포함하는 비닐 봉투를 열고 멸균 거즈를 제거합니다. 아가 로스 젤 사이에 기포에 대한 모든 조직을 검사하고 삽입합니다. 삽입 영역, 결함이있는 조직 또는 조직의 WHI의> 50 % 삽입 커버 아래 기포와 문화를 사용하지 마십시오 채널 완전히 액체로 덮여있다. 시험 기사 또는 제어 코드와 노출 시간으로 6 웰 플레이트 레이블. (키트에 제공됨) 정량법 중간의 분취 량 1.0 ㎖를, 미리 라벨링 된 6 웰 플레이트의 웰에, 약 37 ℃로 미리 가온. 레이블 6 웰 플레이트에 삽입 RHCE 조직을 포함하는 각 삽입을 제거하고 배치 멸균 집게를 사용합니다. 이 단계 동안, 멸균 여과지에 블 롯팅하여 부드러운 삽입물의 외측에 부착 나머지 배송 아가 로스를 제거한다. 삽입 아래에 갇혀있는 공기 방울을 놓습니다. 1 시간 동안 (37 ± 1 ℃에서 5 ± 1 % CO 2 SCC, 습한 대기) 표준 배양 조건에 6 웰 플레이트에서 RHCE 조직을 사전 품어. 1 시간 후, 37 ℃로 데워진 신선한 분석 중간 1.0 mL로 분석 매체를 교체하고 SCC 조건에서 RHCE 조직을 품어 (하룻밤 = O / N) (16-24 시간). . ove_title "> 2 전처리 – 1 일 O / N 배양 한 후, 적절한 피펫 팅 장치를 사용 (제공 DPBS) 칼슘 마그네슘 2 + – 무료 – 둘 베코의 인산염 완충 생리 식염수의 20 μl를 적용합니다. DPBS이 조직에 분산하지 않는 경우, 부드럽게 DPBS 전체 조직 표면을 젖게 할 수 있도록 보장 접시에 삽입을 누릅니다. 30 ± 2 분 동안 SCC에서 RHCE 조직을 품어. 이 단계는 조직의 수분에 필요한 생체 조건에서 모방 참고. 3. 시험 재료 노출 절차 RHCE 조직이 발생하도록 각각의 시험 물질 및 제어를 적용 (N = 2). 테스트 문서 투약 절차는 액체 및 고체 다릅니다. 국소 피펫을 사용하여 액체 테스트 기사의 50 μl를 적용합니다. 액체에 대한 노출 시간은 30 분이다. (염화 나트륨 50 mg의를 개최 보정) 수평 숟가락을 사용하여 고체 시험 기사의 50 mg의 적용합니다. 전고체에 대한 브라케팅 프로그램, 노출 시간은 6 시간이다. 주 : 액체가 피펫 팅 장치를 이용하여 적용 할 수있는 액체 물질 (예를 들어, 액체, 겔 및 크림)로 정의된다. 고체 피펫을 사용하여 적용 할 수없는 비 유체 물질 (예를 들면, 분말, 수지 또는 왁스 물질)로 정의됩니다. 테스트 물품의 물리적 상태를 결정하는 것은 용이하지 않으면, 15 분 (37 ℃)에 대한 수욕 시험품과 튜브를 배치했다. 37 ℃에서 액화 그 시험 기사에 대한 액체 EIT 프로토콜을 따르십시오. 특히 점성 물질에 대한 긍정적 인 변위 피펫을 사용합니다. 먼저 음성 대조군과 양성 대조군을 투약 한 후 테스트 기사를 선량. 음성 대조군 (NC) 및 표준 피펫을 사용하여 RHCE 조직에 양성 대조군 (PC)의 50 μl를 적용합니다. NC는 멸균 탈 이온수이다; PC는 메틸 아세테이트 (CAS 번호 79-20-9)이다. 때 시험 30 분 동안 NC와 PC 적용액체 테스트 기사를 보내고 6 시간 동안 고체 테스트 제품을 테스트 할 때. 4. 시험 제 노출 – 1 일 액체 시험 기사의 치료를 위해. 표 3에 주어진 타이밍 일정을 따라 모든 조직에 대한 동일한 노출을 보장하기 위해 각 테스트 문서의 응용 프로그램 사이에서 1 분 간격으로 둡니다. 30 ± 2 분 전처리 후 DPBS, 국소 국소 적절한 페팅 장치를 사용하여 조직에 RHCE 50 NC 및 PC의 μL, 각 액체 시험 물질을 적용한다. 상부면을 다루 직접 조직에 액체 테스트 문서의 50 μl를 적용합니다. 점성 물질의 구멍을 넓혀 피펫 팁의 좁은 지점을 잘라. 점성 재료, 투약 장치 시험품 (티슈 삽입 또는 플라스틱 압정의 내경보다 약간 작은 직경의 평평한 향하고 실린더)를 적용, 투여 D 반전evice과 조직에 배치 시험 문서는 균일하게 접촉 조직 표면을되도록. 테스트 문서는 조직에 분산하지 않는 경우, 부드럽게 전체 조직 표면에 퍼져 있는지 확인 삽입을 누릅니다. 기계 (피펫 팁으로, 예를 들어) 시험 기사의 확산은 조직에 손상을 줄 수 있기 때문에 사용하지 않는 것이 좋습니다. 30 ± 2 분 동안 SCC에서 조직을 품어. 고체 시험 기사의 치료를 위해 -. 1 일, 표 4에 주어진 타이밍 일정을 따라 모든 조직에 대한 동일한 노출을 보장하기 위해 각 테스트 문서의 응용 프로그램 사이에서 2 분 간격을 둡니다. 30 ± 2 분 전처리 후 DPBS, 국소 적당한 피펫 팅 장치를 이용 RHCE 조직에 50 μL의 NC와 PC를 적용. 고체 테스트 문서 응용 프로그램의 경우 삽입물을 제거 (N = 2) 우물에서와은 (멸균 표면에 그들을 배치 예를 들어, 오전 뚜껑ultiwell 판) 매체에 흘리 테스트 문서를 방지 할 수 있습니다. 계단이 숟가락을 사용하여, 국소 적 조직 표면 상에 시험 물질의 약 50 mg의 적용; 조직의 표면이 완전히 테스트 문서에 포함되어 있는지 확인하십시오. 시험 물질은 조직에 분산되지 않는 경우, 조직이 완전히 시험 물질에 의해 커버되도록 좌우로 부드럽게 삽입을 흔들어. 기계 (피펫 팁으로, 예를 들어) 시험 기사의 확산은 조직에 손상을 줄 수 있기 때문에 사용하지 않는 것이 좋습니다. 필요한 경우, 시험 물질과 조직 사이에 더 나은 접촉을 보장하기 위해 박격포와 유 봉 결정 성 분말을 분쇄. 또한, 머리와 1 ML의 주사기를 사용하여 삽입 내부의 조직 배양에 직접 장소 분말은 차단. 주사기에 물건 분말은 플런저 다시 그린 후 아래로 플런저를 눌러 적용됩니다. 인서트의 외벽이 C 인 경우ontaminated 예를 들어, 분말에 의해, 멸균 거즈로 입자를 닦아. 투여 한 후, 배양 배지를 함유하는 6- 웰 플레이트에 조직을 반환하고 15 분 ± 6 시간 동안 부화 SCC. 5. 린스 시험 문서에 세 깨끗한 비커 (150 mL의 용량)의 세트를 준비하고 DPBS 100 ㎖로 그들 각각을 입력합니다. 각 테스트 기사를 들어, 세 개의 비커의 다른 세트를 사용한다. 30 ± 2 분, 액체 재료에 대한 노출 또는 고체 물질에 대한 15 분의 노출 ± 6 시간의 끝에서 제거하고 사용 하였을 경우 투여 장치를 폐기. 미세 집게로 플라스틱 '칼라'의 상단 모서리를 잡고 매체 중 RHCE 조직을 포함하는 인서트를 들어 올립니다. 취급 및 디캔팅을 용이하게하기 위해 곡선 집게를 사용합니다. 집게를 사용하여 칼라에 의해 서로 중복 인서트를 유지함으로써 한 번에 두 개의 조직을 헹군다. 주의 N 수집게와 조직을 손상 OT. 깨끗한 흡수성 재료 상 조직 표면에서 시험 기사 또는 컨트롤 (종이 타월, 거즈 등) 따르다 , DPBS, 약 2 초 동안 DPBS에 원을 그리 소용돌이의 첫 번째 비커에 삽입을 찍어 그들은 대부분 DPBS로 가득되도록 삽입을 들어, 다시 비커에 액체를 가만히 따르다. 첫 번째 비커에이 과정을 세 번 반복합니다. 동일한 방식으로 3 회 DPBS의 두 번째 및 세 번째 비커에 삽입 헹군다. 흡수 물질에 삽입에 남아있는 액체를 가만히 따르다. 대략 45 ° 각도 (오픈 엔드 아래)에 삽입을 돌려 흡수 물질로 윗입술을 터치합니다. 주 : 볼 시험 물질을 모두 제거 할 수없는 경우, 더 린스가없는 과도한 처리에 조직 손상을 방지하기 위해 수행되어야한다. 6. 후 흡수 세척 한 후,직전 미리 라벨링 된 12 웰 플레이트에서 RT로 가온 정량법 중간 5ml에 조직 몰입. 액체 재료의 12 ± 2 분, 또는 임의의 잔여 시험 물질의 제거를 용이하게하기 위하여 RT에 침지하여 고체 물질의 25 ± 2 분 동안 조직을 배양한다. 7. 후 배양 끝나면 침지 기간 후 담근다 조직으로부터 정량법 중간 캔트 및 흡수성 재료에 삽입시킨다. 따뜻한 중간 정량법 1 ㎖를 함유하는 미리 라벨링 된 6 웰 플레이트에 삽입물을 전송. 액체 시험 물질에 대한 SCC에서 120 ± 15 분 동안 조직을 품어. 고체 시험 물질에 대한 SCC에서 18 ± 0.25 시간 동안 조직을 품어. 8. MTT 생존 분석 – 1 일 (액체 프로토콜)과 2 일 (고체위한 프로토콜) (120)의 후 배양 후 MTT 분석을 수행77; 액체 15 분 각각 고형분 18 ± 0.25 시간,. 미리 라벨링 된 24- 웰 플레이트의 각 웰에 1.0 ㎎ / ㎖ MTT 용액 및 용액의 분취 액 0.3 mL로 제조. 상업 MTT 키트 (표 5)를 사용하여 : 사용하기 전에 2 시간은 실온에서 MTT 집중을 해동. 2 MTT 농축 mL 및 1.0 ㎎ / ㎖ MTT 용액을 생성하기 위해 MTT 희석제 8ml의 결합. 사용할 때까지 어둠 속에서 4 ° C에서 MTT 솔루션을 저장합니다. 1 개 이상 하루 MTT 솔루션을 보관하지 마십시오. 포스트 인큐베이션의 끝에, 6- 웰 플레이트에서 각각의 삽입 체를 분리하고 부드럽게 흡수 물질에시킨다. MTT 용액 0.3 ml에 포함 된 24 웰 플레이트에 삽입을 놓습니다. 삽입 아래에 갇혀있는 공기 방울을 놓습니다. SCC에서 180 ± 10 분 동안 접시를 품어. MTT 추출 MTT 용액에서 180 ± 10 분 부화 후, 각각의 삽입물을 분리및 24- 웰 플레이트로부터 흡수성 재료에 인서트의 바닥을시킨다. 비 착색제 액체 테스트 제품 (침수 추출)의 경우 :이 삽입 잠기도록 추출 제 솔루션 (이소프로판올)의 2.0 ml의를 포함하는 미리 라벨링 24 웰 플레이트에 삽입을 전송합니다. 고체와 액체의 착색제를 들어 (비 침수 추출 용매 용액의 오염을 방지 할 추출)이 삽입 잠수함 않도록 추출 용매 용액 1.0 ㎖ (이소프로판올)을 함유하는 미리 라벨링 된 6 웰 플레이트에 삽입물을 전송. 참고 : 해당 부정과 긍정적 인 컨트롤 같은 비 침수 추출을 수행합니다. (플레이트 커버와 우물의 상단 가장자리 사이의 또는 표준 플레이트 실러와 파라 필름으로, 예를 들어) 판을 밀봉. 궤도 판 쉐이커에 접시를 놓고 MTT를 추출하기 위해 2 실온에서 시간 3 흔들어. 또한, 2-8에서 추출 O / N을 수행76, 흔들림없이 어둠 속에서 C. 비 액체 착색제 시험 기사 (잠긴 추출)의 경우 : 추출 기간의 끝에서, 각각의 액체가 다시 잘 삽입 및 RHCE 조직과 삽입물을 폐기 가만히 따르다. 추출액을 혼합하고, 플레이트의 구성 (도 2)에있어서 미리 라벨링 된 96- 웰 플레이트의 적당한 웰에 두 200 μL 분취를 전송. 고체와 액체 염료 (비 침수 추출)의 경우 : 추출 기간이 종료되면 조직이 (조직을 관통하지 않도록주의) 폐기합니다. 조직으로부터 추출 된 용액을 함유하는 24- 웰 플레이트의 각 웰에 추출 용매의 용액 1.0 mL로 추가한다. 추출 용매 용액을 혼합하고 상기 플레이트의 구성 (도 2)에있어서 미리 라벨링 된 96- 웰 플레이트의 적당한 웰에 두 200 μL 씩 옮긴다. T를 결정그는 550 및 590 nm의 사이에 단일 파장에서 추출 된 샘플의 광학 밀도 (OD) 플레이트 리더 또는 분광 광도계에 (실험실 내에서 일치해야합니다). 불용성 고체로 인한 혼탁 추출물 솔루션, 원심 분리기 외경 (증발을 방지하기 위해 4 ° C에서 원심 분리기를 냉각)를 측정하기 전에 솔루션을 경우. 경우 세정의 테스트 문서 (TA)를 제거하지 않고 TA는 MTT 감소 방해, 추가 컨트롤을 사용할 수 있어야합니다. MTT 감소 (16)을 보정하기 위해 상세한 SOP를 참조하십시오. 경우 TA가 갖도록, 또는 MTT 측정과 상호 작용할 수있는 발색 도시되어, 추가적인 테스트가 바인딩 색상의 양을 결정하기 위해 수행되고,이어서 조직으로부터 추출한다. 컬러 테스트 제 16 조를 수정하기 위해 상세한 SOP를 참조하십시오. 조직의 생존 능력 시험 (표 6과 그림 3) & # 9. 계산(160); 일반 계산 각 실험에 대한 빈 제어 우물 (OD BLK)의 평균 OD 값을 계산합니다. 같은 실험 (BLK 데이터를 수정)의 각 OD 값에서 OD (BLK)을 뺍니다. 각각의 조직 (= 보정 OD)를위한 두 개의 분취 량의 평균값을 계산한다. 평균 대조군 (100 % 컨트롤)을 각각 제어하고 시험품 상대적인 두 복제 각 조직의 생존 백분율을 계산한다. 생존율 (%) = [보정 된 OD 처리 조직 / 보정 OD 음성 대조군] × 100 % 생존 능력 (복제 두 조직 간 생존력 차이)의 차이를 계산한다. 평균 시험품 생존율 (TA 생존)를 계산하고 예측 모델에 따른 시험품을 분류. 10. 예측 모델 (그림 3) TA-처리 조직의 생존 능력은 NC 처리 조직 V에> 60.0 상대 인 경우iability는 비 – 자극성 (NI)와 같은 시험 물질 (GHS 없음 카테고리) 라벨. TA 처리 조직 생존력이 NC 처리 조직 생존에 대하여 60.0 ≤이면 자극 (I)로서 시험품 레이블 (GHS 카테고리 1 및 2). 참고 : EIT 시험 결과의 경우 자격을 갖춘 것으로 간주됩니다 : EIT NC 외경> 0.8 <2.5; (NC 상대적 %) EIT PC 조직 생존율 ≤50.0 %이고; 두 복제 조직 (NC, PC, 테스트 문서)의 차이는 20.0 % <이다.