Baseada em Silk-colágeno Engineered 3D Model of Tissue polarizada Neural

O protocolo de isolamento tecido cerebral foi aprovado pelo Comitê da Universidade Tufts Animal Care Institucional e Use e está em conformidade com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Institutional Animal Care e do Comitê Use B2011-45). 1. Silk Andaime Preparação Preparação de solução de seda Bombyx mori casulos como descrito anteriormente 19,20. Corte cada casulo em 8 pedaços iguais usando uma tesoura. Use cerca de 11 casulos para 5 g de casulos fragmentados. (15 min) Prepare 2 L de 0,02 M Na 2 CO 3 solução e trazê-lo para ferver utilizando um prato quente. (15 min) Pesar 5 g de casulos fragmentados e ferve-las em Na 2 CO 3 solução durante 30 min. Agita-se a seda ferver a cada dois minutos com uma espátula. Esta etapa, também chamado de-resinagem, purifica fibroína de seda a partir de proteínas hidrófilas, sericins. (30 min) <li> Torça o fibro�a à mão e lave-o em água destilada pelo menos três vezes para lavar qualquer sericina restante e produtos químicos. (5 min) Coloque a fibroína molhado numa placa de Petri e secar o extracto de fibroína na câmara de fluxo S / N. No dia seguinte, pesar a massa seca fibroína e colocar a fibroína numa proveta de vidro. (15 min) A fim de dissolver a fibroína em 9,3 M solução de LiBr, calcular o volume necessário (em ml) de LiBr multiplicando a massa de fibroína seco por 4. verter lentamente sobre solução de LiBr a fibroína de seda e mergulhe todas as fibras de fibroína usando uma espátula. Tapar o copo para evitar a evaporação e colocá-lo a 60 ° C durante 4 horas para permitir que as fibras se dissolva. (15 min) Usando a seringa, recolher a solução fibro�a do copo e carregá-lo para os MWCO 3.500 cassetes de diálise. Executar a diálise contra água destilada durante 48 horas. Troque a água a cada duas horas. Usando a seringa, recolher a solução de fibroínaas cassetes em tubos de 50 ml de centrífuga cónicos e duas vezes a 9000 rpm (~ 12.700 xg) a 4 ° C durante 20 min. Verter o sobrenadante para um tubo fresco após cada passo de centrifugação e descarte do sedimento. (40 min) Medir a concentração de fibroína através da estimativa do peso seco. Despeje 1 ml de solução de seda em um barco pesar. Seca-se a amostra no forno a 60 ° C durante 2 horas. Pesar a fibroína de seda seca e calcular a concentração de uma solução de fibroína de seda, multiplicando o peso obtido por 100. A concentração esperada de solução de seda é de 6-9% (w / v). Ajustar a concentração de seda a 6% (w / v) diluindo-o em água destilada. Ponto de paragem: O líquido de fibroína de seda pode ser armazenado a 4 ° C durante até um mês em um recipiente fechado. Preparação de matrizes porosas a partir de solução de seda. Peneirar o granulado de NaCl para separar os grânulos de tamanho 500-600 um, que será utilizado nas etapas posteriores. Descartar o grânulos dimensionados abaixo de 500 um e acima de 600 um. (15 min) Pour 30 ml de solução de seda 6% no molde de politetrafluoretileno (PTFE) (Figura 1). Delicadamente espalhar 60 g de NaCl peneirada sobre a seda. Toque no recipiente para se obter uma camada uniforme de sal. Incubar 48 horas à temperatura ambiente para polimerizar o seda. Coloque o molde de PTFE contendo andaime no forno a 60 ° C durante 1 h para finalizar a polimerização e evapora-se o líquido restante. Colocar o conteúdo do molde de PTFE num copo contendo 2 L de água destilada durante 48 horas para lixiviar o sal. Troque a água 2-3 vezes por dia. Remover os andaimes de esponja dos moldes quando o sal é completamente lixiviado para fora do ponto final:. As esponjas podem ser armazenadas imersas em água a 4 ° C num recipiente fechado para evitar que os suportes de desidratação. Quando estiver pronto, cortar os andaimes com 5 milímetros de diâmetro biópsia soco. Pré-cortar os andaimes para chegar a cerca de 2 mm de altura. PuNCH ​​para fora do centro do andaime com a 2 mm de diâmetro punção para biópsia (Figura 2A). (1 h) Autoclave os andaimes imersas em água para esterilizá-los (ciclo molhado, 121 ° C, 20 min) Ponto de paragem:. As esponjas podem ser armazenadas imersas em água a 4 ° C num recipiente fechado para evitar que os suportes de desidratação. Antes da sementeira celular prevista, imergir os suportes na solução estéril a 0,1 mg / ml de poli-D-lisina (PDL). Incubar durante 1 hora a 37 ° C. Lavar os andaimes 3x com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover PDL não ligado. (30 min) 2. Isolamento de Rato Os neurónios corticais Dissecar córtices do dia embrionário 18 ratos (E18) Sprague-Dawley como previamente descrito por Pacifici e Peruzzi 27 após protocolo de animais aprovado seja obtido. (2 h) Incubar 10 córtices em 5 ml de 0,25% de tripsina com 0,3% de DNase I (a partir de pâncreas bovino) durante 20 min a 37 ° C. Inactivar a tripsina por adição de igual volume de 1 mg / ml de proteína de soja. Triturar os córtices usando 10 ml de pipeta Pasteur por pipetagem cima e para baixo 20 vezes, até uma suspensão única célula é gerada. Seja gentil e evitar a formação de bolhas de ar. (10 min) Centrifugar a suspensão de células a 127 xg durante 5 min. Re-suspender o sedimento celular em 10 ml de meio de cultura (meio Neurobasal, 1x suplemento de B27, 1x Glutamax, 1% de penicilina / estreptomicina). Contar as células. A concentração de células é de cerca de 2×10 esperado 7 / ml. (20 min) 3. Construa Assembleia e Cultura Semeadura andaime com células. Mova os andaimes estéreis e todos os utensílios necessários dentro de uma capa de cultura de célula. Utilizando fórceps estéreis os colocar andaimes em uma placa de 96 poços de cultura de células alocar um andaime por poço. (10 min) Mergulhe os andaimes em meio de cultura de células para equilibrar-los antes para a célula de sementesing. Incubar durante 1 hora a 37 ° C. (10 min) Aspirar o excesso de a forma de andaimes. Aplicar 100 ul de suspensão de células / andaime. (10 min) Incubar as células a 37 ° CO / N para permitir a fixação de células ao andaime. Na manhã seguinte aspirar as células não ligadas e aplicar 200 ul / poço de meio de cultura fresco. (10 min) Andaime com a incorporação de matriz de colagénio. (2 h) Coloque 10x PBS, água, NaOH 1 N e rato cauda I colágeno no gelo. Preparar uma solução de trabalho de colagénio de acordo com as instruções do fabricante. Manter em gelo até que as construções de células semeadas está pronto (até 1 hora). Retirar as construções de células-seda semeado da incubadora e aspirar o excesso de meio. Utilizando fórceps estéreis os andaimes para transferir os poços vazios na placa e assim imergir cada andaime em 100 ul de solução de colagénio de 3 mg / ml. Coloque a placa de cultura de tecidos de voltana incubadora durante 30 min para permitir a polimerização do colagénio. Adicionar 100 ul de meio de cultura de células pré-aquecido / poço. Cultura das construções durante uma semana de mudar o meio todos os dias, substituindo metade do volume do meio. 4. Análise de Microscopia Coloração Live / mortos (1 hr) Preparar a solução de estoque de iodeto de propídio (PI) a 1 mg / ml (1,5 mM) em água destilada. Preparar a solução de estoque de diacetato de fluoresceína (FDA) de 2 mg / ml em acetona. Preparar uma solução de trabalho contendo 10 PI uM e 0,15 uM FDA diluído em PBS. Pré-aquecer a solução a 37 ° C num banho de água. Lavam-se as células com PBS pré-aquecido para remover as esterases do soro. Aspirar o PBS. Aplicar a solução pré-aquecida de trabalho sobre as células durante 2 minutos e lavá-lo com PBS. Uso de microscópio de epifluorescência a imagem das células (PI ex λ = 490 nm, em λ = 570 nm; FDA ex λ = 490 nm, em λ = 514 nm). A mancha permanece estável ao longo de 40 min. Coloração prolongado pode resultar em coloração inespecífica resultante da absorção pelas células PI e de co-localização de PI / FDA em células. Immunostaining No ponto de tempo de cultura desejado fixar as células com paraformaldeído a 4% (PFA) durante 30 min à TA. Devido à toxicidade do PFA emanações o passo de fixação deve ser realizada na hotte química. Lavar 3x com PBS andaimes Ponto de paragem:. As construções de PFA-fixadas podem ser armazenadas em PBS a 4 ° C durante vários dias antes de prosseguir com outros passos. Incubar os andaimes em 0,2% de Triton, 0,25% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS contendo anticorpo primário O / N a 4 ° C. No dia seguinte descartar a solução de coloração e lavar os andaimes 3 x 30 min com PBS para remover o anticorpo primário não ligado. Incubar as amostras com anticorpo secundário diluído em 0,2% de Triton, 0,25% de BSA em PBS durante 2h à TA. Remover a solução de coloração e lavar os andaimes 3 x 30 min com PBS para remover o anticorpo secundário não ligado. Imagem andaimes utilizando um microscópio confocal com objetivo 20X, tendo 100 mm z-seções da amostra com 1 um passo. Para visualizar as neurites finas a resolução da imagem deve ser de no mínimo 1.024 x 1.024 pixels. ARN, ADN e o isolamento das proteínas Nota: RNA, DNA e isolamento de proteínas é realizada utilizando um ADN comercial AllPrep / ARN / proteína Mini Kit de acordo com as instruções do fabricante. Utilizando uma pinça estéril transferir os andaimes de placa de cultura para um tubo de 2 ml estéril. Coloque um andaime por tubo. Adicionar 200 ul de tampão RLT a cada tubo. Disrupt a construção fragmentando-o com microtesoura estéreis. Para homogeneizar o tecido perturbado, transferir o conteúdo do tubo para a coluna de centrifugação. Girar por 2 min a toda a velocidade numa micro.O lisado é homogeneizado à medida que passa através da coluna de spin. Recolhe-se o fluxo através e utilizá-la imediatamente para isolar o ARN, ADN e proteína, seguindo o protocolo do fabricante. Quantificar a produção dos ácidos nucleicos de qualquer outro método compatível (por exemplo, NanoDrop). Quantificar a produção de proteína utilizando o BCA Protein Assay de acordo com as instruções do fabricante. Medir o resultado de ensaio usando leitor de microplacas a 562 nm de comprimento de onda. Nota: O rendimento esperado de ácidos nucleicos e proteínas, por construção, em relação à densidade de células é mostrada na Figura 4.