JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
发育生物学

Microperla impianto nel zebrafish

Published: July 30, 2015
doi:
10.3791/52943
, ,
1Department of Biological Sciences,University of Notre Dame

Summary

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Abstract

Il pesce zebra è emerso come un valido sistema di modello genetico per lo studio della biologia dello sviluppo e della malattia. Zebrafish condividono un alto grado di conservazione genomica, nonché similarità nei processi cellulari, molecolari e fisiologici, con altri vertebrati compresi gli esseri umani. Durante la prima ontogenesi, embrioni di zebrafish sono otticamente trasparente, consentendo ai ricercatori di visualizzare la dinamica di organogenesi utilizzando un semplice stereomicroscopio. Impiantazione microperla è un metodo che permette la manipolazione dei tessuti attraverso l'alterazione dei fattori negli ambienti locali. Questo permette ai ricercatori di saggiare gli effetti di un qualsiasi numero di molecole di segnalazione di interesse, come i peptidi secreti, nei punti spaziali e temporali specifiche all'interno dell'embrione in via di sviluppo. Qui, i dettagli di un protocollo per il modo di manipolare e perline impianti durante le prime fasi di sviluppo zebrafish.

Introduction

I ricercatori di biologia dello sviluppo utilizzano una vasta gamma di metodi di cellulari, molecolari e genetici per scoprire i meccanismi che controllano come si forma un organismo. Tra questi approcci, manipolazione dei tessuti è uno strumento chiave nel decifrare questioni complesse circa il destino della cellula, il movimento cellulare, e l'organizzazione dei tessuti. Un modo per alterare ambienti locali tissutali è attraverso l'applicazione chirurgica di microsfere che sono utilizzati per fornire una sorgente focale di proteine ​​o altre molecole di segnalazione 1. Questo tipo di manipolazione sperimentale è stato ampiamente implementato in classici modelli embriologia vertebrati, come la rana e pulcino 2.

Il pesce zebra è diventato un importante organismo modello vertebrato per lo studio della organogenesi e fornisce anche molti vantaggi unici per la modellazione malattia 3-5 in quanto condividono la conservazione genetica alto con gli esseri umani 6. In particolare, la trasparenza ottica ed exsviluppo Ternal dell'embrione zebrafish offre un punto di vista senza pari per l'osservazione del tessuto ontogenesi 3-5. La realizzazione di schermi genetici forward grandi ha generato un potente repository di ceppi mutanti zebrafish per ulteriori studi 7,8, e l'identificazione di tecniche di screening alternativi che possono essere efficacemente condotta a scala ridotta in singoli laboratori 9,10. Ulteriore lavoro sperimentale con zebrafish è stata facilitata grazie ai progressi nelle metodologie transgeniche e invertire approcci genetici 11,12, così come la genetica chimici 13-15.

Tecniche di manipolazione dei tessuti, come la realizzazione di microsfere, non sono stati così ampiamente impiegato nel zebrafish, ma comunque fornire uno strumento utile per comprendere ulteriormente la segnalazione delle cellule durante lo sviluppo. Microperla impianto è stato utilizzato per interrogare i processi di formazione dell'organo nella retina zebrafish16,17, 18 cuore, il cervello 19-22, neural crest 23, e fin 24,25. In questi ed altri studi, perline sono state applicate durante lo sviluppo per comprendere la diffusione delle molecole di segnalazione 26, come gradienti influenzano migrazione cellulare 27 e assiale patterning 28. Più recentemente, microsfere sono stati utilizzati per valutare i meccanismi di rigenerazione in adulti zebrafish 29. Negli studi di sviluppo, ad esempio, il lavoro microperla zebrafish ha fornito informazioni sui meccanismi di formazione degli arti attraverso studi della pinna pettorale 25. Il pesce zebra pettorali germoglio pinna è omologa al germoglio arti anteriori nel topo 30 e pulcino 31. La gemma vertebrati arto ha due nodi fondamentali di segnalazione: la zona di attività polarizzante (ZPA), che stabilisce l'asse anteriore-posteriore attraverso l'espressione di Sonic hedgehog (Shh) ea valle geni bersaglio Hox,e la cresta ectodermica apicale (ARE) presente sulla punta della gemma dell'arto, che agisce per stabilire prossimale all'identità distale degli arti attraverso l'espressione di fattori di crescita dei fibroblasti (Fgfs). Con l'impianto di microsfere Fgf imbevuti in zebrafish mutanti genetici Shh, investigatori identificato Fgf come essenziale per la progressione del ciclo cellulare e la crescita dell'arto vertebrati 25. In aggiunta a FGF e Shh cascate di segnalazione che stabiliscono identità posizionale, studi pionieristici utilizzando la gemma pulcino arto identificato acido retinoico (RA) come una molecola che potrebbe mimare l'azione della regione polarizzatore per stabilire anteriore a posteriore identità 32. Questi esperimenti coinvolti mettendo piccole strisce di carta Whatman RA-impregnato nella arto pulcino di valutare cifre patterning 32. Inoltre, i ricercatori hanno eseguito altri studi eleganti che impiegano l'uso di microsfere, trapianto di cellule, ed esogenoTrattamenti RA in zebrafish per determinare che RA agisce per fornire a lungo raggio spunti di posizione all'interno romboencefalo zebrafish e mesoderma 28. Tuttavia, attualmente molte domande rimangono circa i ruoli di segnalazione fattori come Fgf e RA durante numerosi aspetti dello sviluppo dei vertebrati. Gli effetti di segnalazione di RA, che agisce come un morfogeno, incidono molti organi 33, come il cuore lo sviluppo 34 e progenitori renali, dove RA specifica cellule renali prossimali tipo destino 35-39. Ulteriore comprensione di tali argomenti potrebbe beneficiare in modo significativo da studi sperimentali che utilizzano tecniche di manipolazione dei tessuti e microperla impianto.

Mentre meno studi sono stati condotti con microperla impianto in zebrafish, rispetto a modelli come il pulcino, quelli che sono stati eseguiti sono stati altamente informativo. Uno dei motivi per la scarsità di microbead impianto-ricerca con sede nell'embrione zebrafish è likely la nozione che ci sono difficili sfide tecniche, in base alle dimensioni dell'embrione, che costituiscono un impedimento per eseguire con successo tali manipolazioni. Tuttavia, microbead impianto in embrioni di zebrafish può essere apprese con la pratica e assistito attraverso l'osservazione visiva della tecnica, e quindi può essere perseguito come un mezzo per interrogare i meccanismi di sviluppo. Qui, dimostriamo l'applicazione precisa di una microbead nell'embrione zebrafish, che può essere utilizzato per condurre una vasta varietà di saggi di formazione del tessuto e la morfogenesi cellulare.

Protocol

Le procedure per l'utilizzo di embrioni di zebrafish descritte in questo protocollo sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale presso l'Università di Notre Dame. Soluzione Preparazione di 1. Ringer Fare una soluzione di 116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 3,6 mM CaCl 2, e 5 mm con Hepes ultrapuro H 2 O attraverso una continua agitazione per evitare qualsiasi precipitazione di sali. Dopo aggiunta di sali e mentre la soluzione è ancora agitazione, aggiungere 100 unità / mL di penicillina per e 100 mg di streptomicina per ml. Dopo aver aggiunto tutti gli antibiotici e sali, effettuare Filtro sterilizzante della soluzione e conservare in contenitore sterile. Nota: N-feniltiourea (1-fenil-2-tiourea) o PTU possono essere aggiunti alla soluzione di Ringer di bloccare la formazione di pigmento in perline embrioni impiantati senza conseguenze negative per la salute embrione. Per preparare la soluzione di blocco / pigmentazione di Ringer, utilizzare un concenzione del 0,003% PTU. A causa della bassa concentrazione di PTU da aggiungere si consiglia un volume maggiore di soluzione di Ringer essere fatta almeno 1 L, per evitare di aggiungere minuscole quantità di polvere PTU. Aggiungere PTU durante il passaggio 1.2, mentre la soluzione si agita. 2. Tricaine Soluzione Preparazione Aggiungere 2 g di etil 3-amminobenzoato sale metansolfonato (Tricaine) per l di soluzione più 0,1 M Tris, da uno stock 1 M equilibrata a pH 9,5 fornito con ultrapura H 2 O. Nota: Tricaine sarà utilizzato euthanize gli embrioni zebrafish al punto di tempo desiderato per eseguire il test del branello fenotipi impianto. 3. E3 Soluzione Preparazione Fare una soluzione di 0,25 M NaCl, KCl 10 mM, 12,5 mM CaCl 2, e 16,6 mM MgSO 4 a 1 L di acqua ultrapura per creare 1 L di E3. Aggiungere 200 ml di blu di metilene alla soluzione E3 per inibire la crescita fungina. 4. Aghi Pulling per Microbead Transfer Utilizzare Sfaccettate vetro borosilicato con filamento ad un OD: 1,0 mm ID 0,5 mm, una lunghezza di 10 cm. Posizionare il vetro borosilicato in un estrattore micropipetta per preparare aghi sottili. Nota: I seguenti quattro dimensioni può essere utilizzato come punto di partenza per tirare gli aghi: Calore = 540, Pull = 245, velocità = 200, e ora = 125. Dopo aver tirato un numero adeguato di aghi, conservare in plastica coperto petri piatti, posizionate su strisce di pasta modellabile o nastro adesivo per evitare la rottura della punta dell'ago, fino al momento dell'uso. Per tagliare la punta dell'ago per il diametro desiderato, utilizzare un paio di pinze sottili a segnare la fine dell'ago. Nota: Ago diametro varia a seconda delle dimensioni microbead essere utilizzato così come preferenze Gestione utente. Un buon punto di partenza è quello di diametri mestiere in un range tra 100 e 200 micron se saranno utilizzati microperle che vanno 50-100 micron. Prior da utilizzare, inserire l'ago tagliato nel supporto tubo capillare di moda lo strumento di trasferimento microperla completato. 5. Baffo / Lash Preparation Tool Ottenere un soffio, scatenarsi, o un altro piccolo pezzo ma ferma di filamento capelli naturali o sintetici. Tagliare vicino alla base del filamento ad un angolo di 45 °. Rispettare il baffo di un P-1000 micropipetta punta usando permanente chiaro colla adesiva. 6. microperla impianto Tray Preparazione Mescolare 2 g di agarosio con 100 ml di soluzione E3 per fare un E3 gel di agarosio al 2%. Riscaldare la soluzione di agarosio al 2% per 1 min e 30 sec in un pallone da 250 ml Erlenmeyer, agitando il matraccio ogni 30 secondi per evitare il gel dalla traboccante. Prendere il coperchio di una x 15 mm di Petri 60 mm e posizionarlo in un grande 150 millimetri piatto x 15 mm con l'interno rivolto verso l'alto. Versare il gel caldo nella x 15 mm Petri 150 mm, avendo cura di ancorare giùil coperchio del piatto più piccola con il dito indice. Nota: Consentire un sottile strato di agarosio al di sotto del coperchio del piatto più piccolo per rimuovere la condensa che si forma quando si versa il gel; questo renderà le perle più facile vedere al microscopio dissezione. Come l'agarosio si raffredda, ma prima che si solidifica, posizionare uno stampo ben sul gel. Ciò consentirà per facilitare il posizionamento degli embrioni. Nota: Per evitare bolle nei pozzetti, posizionare lo stampo lentamente con un angolo fino a che galleggia sulla superficie del gel. Utilizzando un microspatula, rimuovere con attenzione lo stampo bene una volta il gel si è solidificato. Aggiungere la soluzione E3 e conservare a 4 ° C. 7. embrioni Collection Preparare le camere di accoppiamento, separati da divisori, da essi riempiendo d'acqua il sistema, e poi mettendo maschio adulto zebrafish (s) e (s) coppie di sesso femminile nelle camere di O / N. Raccogliere uova fecondate con un colino rete metallica (stadi embrionali possono variare leggermente). Depositare le uova fecondate in una, dieci centimetri di diametro piatto di Petri pulita ruotando il filtro a testa in giù e risciacquo con un bel flusso di E3 finché non ci sono le uova rimaste nel colino, e ci circa 25 ml di soluzione E3 nel piatto. Dopo la raccolta, dividere le uova in diversi piatti (circa 50-60 uova per piatto) per evitare il sovraffollamento, che potrebbe condurre a asincronia di sviluppo all'interno della frizione e rendere la raccolta di momenti desiderati punti difficili. Incubare gli embrioni in soluzione E3 a 28,5 ° C per consentire la valutazione dello sviluppo secondo la serie messa in scena zebrafish standard a 40. Nota: Gli embrioni devono essere trasferiti E3 / PTU a 24 ore dopo la fecondazione (HPF) per prevenire lo sviluppo di pigmento se manipolazioni nelle fasi più anziani richiedono chiarezza ottica. 8. Bead impianto Incubare le microsfere di concentrazione di prova molecola desiderata o al veicolo corrispondente soluzione per il tempo necessario a un volume adeguato. Nota: Il ricercatore può utilizzare piastre sterili vanno 3-6 cm di diametro, o piastre a più pozzetti, entrambi i quali consentono la visualizzazione delle microsfere all'interno della soluzione. Il tempo può variare a seconda del tipo e della quantità di molecola di interesse, e il ricercatore dovrebbe riferirsi fabbricante o raccomandazioni pubblicate per durata dell'incubazione e altri aspetti come la sensibilità alla luce e temperatura. Una volta che gli embrioni hanno raggiunto il punto di tempo di sviluppo desiderato, rimuovere gli embrioni dai loro chorions utilizzando una pinza sottile. Incubare gli embrioni nella soluzione Ringer filtrata con antibiotici per 10 minuti per loro ambientarsi alla soluzione. Mentre gli embrioni sono acclimating, trasferire le microsfere nella piastra microbead annidato all'interno del vassoio impianto e sciacquare in soluzione Ringer per 10 min. Nota: Impianto le perle a meno di 50 minuti dopo aver raggiunto questo punto. Questo will diminuire la probabilità che uno impiantare un cordone con una minore concentrazione della molecola di interesse. Array gli embrioni nei pozzetti del vassoio microbead impiantazione, avendo cura di orientarle quindi la zona di interesse in cui la microbead sarà impiantato è accessibile. Fai una piccola incisione sull'embrione utilizzando l'ago di tungsteno. Trasferire una microbead sul embrione utilizzando la pipetta di trasferimento microcapillare: premendo il bulbo della pipetta, tirare delicatamente il microbead nella colonna capillare, e poi rilasciare la pressione per trasferire il microbead alla destinazione desiderata. Utilizzare lo strumento basette / sferza per posizionare il microbead all'interno dell'embrione. Nota: Assicurarsi di posizionare il microbead nel tessuto lontano dal sito di incisione in modo che il microbead non sarà espulso dal embrione come si guarisce.

Representative Results

Diversi tipi di strumenti di manipolazione sono utili per il trattamento microsfere durante applicazioni di ricerca (Figura 1). Inoltre, un semplice stampo agarosio con pozzetti può essere utilizzata per tenere l'embrione zebrafish, che è fondamentale per effettuare questi esperimenti in modo tempestivo ed efficace (Figura 1). L'impianto di una microbead può essere eseguita alla posizione spaziale e temporale della fase di interesse, che permette ai ricercatori per limitare una specifica finestra di azione per la molecola di interesse. Qui, singole microsfere sono stati impiantati in embrioni di zebrafish allo stadio bocciolo coda o in successivi momenti durante le fasi somitogenesis (Figura 3). Due microsfere di dimensioni differenti, sciacquati con soluzione di Ringer sola, sono stati utilizzati in questo protocollo dimostrazione (Figura 3A, 3B e 3C). Questo impianto microbead in assenza di qualsiasi coniugatopiccole molecole dimostra che tallone impianto può essere raggiunto senza effetti morfologici lordi durante il corretto sviluppo dell'embrione zebrafish (Figura 4). Il sperimentalista può incontrare difficoltà con la manovra della microbead nel foro di puntura fatta da un ago di tungsteno in cima l'embrione. Per ottenere una migliore gestione del microbead volta immesso sul embrione dal micro-ago, un / strumento ciglia whisker può essere utilizzato. Questo può essere realizzato con cadute naturalmente felino o basette canino, anche se altri filamenti ciglia naturali o sintetici possono essere utilizzati (Figura 1). Una leggera spinta del microbead sia con l'ago di tungsteno o lo strumento baffo dovrebbe vedere la microbead affondare la soluzione di Ringer dello stampo. Una volta che il microbead è affondato nello stampo dovrebbe essere spostato grandi distanze, se necessario, utilizzando l'ago di tungsteno e una volta in cima dell'embrione dell'utensile ago o whisker può essere utilizzato per position per la microbead nell'embrione. Il successo del fissaggio microbead può essere misurata immediatamente attraverso la visualizzazione a uno stereomicroscopio, come il tallone rimane stabilmente posizionato nel tessuto. Per valutare la posizione tallone nel tempo, ogni campione embrione può essere ripreso con vivo time-corso di fotografia o controllato ad intervalli periodici (come illustrato nella Figura 4) per assicurare che la posizione tallone non è spostato sopra la durata dell'esperimento dovuta al tessuto endogeno morfogenesi. Comprensione della posizione del tallone nel tempo è critico per l'interpretazione più informata dei risultati, come valutare l'effetto di una piccola molecola su un tessuto bersaglio o un processo evolutivo. L'uso di questi passaggi sopra fornirà un ambiente ideale per incastonare microsfere nell'embrione zebrafish alla volta e posizione desiderata. Nella nostra esperienza, gli utenti meno esperti di questo protocollo microperla impianto tipicamente guadagnato il ne abilitàsario effettuare impianto chirurgico coerente microsfere nell'embrione zebrafish, dopo circa una settimana di pratica. Figura 1. strumenti utilizzati per eseguire microbead impiantazione. (A) Il vassoio impiantazione tallone (sinistra 15 cm di diametro) con stampi embrione (a sinistra) e un vassoio microbead incubazione (a destra, diametro 6 cm). Questo vassoio di lavoro permette al ricercatore di posizionare gli embrioni nell'orientamento desiderato per microperla impianto, e di avere le microsfere preparati per l'impianto in prossimità alla stazione microscopio. Microsfere devono essere incubate a piccola molecola (s) e / o del veicolo e quindi risciacquati in una piastra separata microbead (destra) prima di posizionarli nel vassoio impiantazione tallone che è posizionato sotto la stazione microscopio. (B) Due coppie di pinza sottile saranno utilizzati per rimuovere il Chorisulla circostante ogni embrione zebrafish e anche a rompere la fine dell'ago microcapillare. (C) Un ago di tungsteno sarà utilizzata per realizzare un sottilissimo foratura nell'embrione zebrafish in cui posizionare il microperla. (D) Il trasferimento pipetta microcapillari sarà utilizzato per prelevare e posizionare un microbead in cima zebrafish vicino al sito della puntura. (E) Il / strumento sferza baffo consentirà il posizionamento dolce del microbead nel sito di incisione all'interno dell'embrione che è stato precedentemente fatto dal ago di tungsteno. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2. Schema del procedimento microbead impianto. (A) Un vassoio impiantazione microbead con microsfere soaking nella soluzione di lavaggio desiderato sia impostato sotto una stazione stereomicroscopio, e gli embrioni posizionati con il tessuto rivolto verso l'alto. (B) Usando un ago di tungsteno, una piccola incisione nella embrione può essere effettuato con un lieve movimento ancora forte. (C) Usando una pipetta di trasferimento microcapillari, il microbead desiderato può essere ritirato dalla camera microbead incubazione nel vassoio, situata a destra, e portato al vano sinistra dove la zona di lavoro embrione è situato. Il microbead deve essere depositato vicino al sito di incisione, poi delicatamente posizionata nel sito di incisione fatta dall'ago tungsteno utilizzando lo strumento / ciglia basette. Una volta che un microbead è manovrato nel sito di incisione, dovrebbe essere inserito nel tessuto (distanza dall'incisione) per posizionare stabilmente la microbead e prevenire successivo movimento fuori dell'embrione come sviluppo continua. Pleasing clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3. microsfere possono essere impiantati in embrioni a diversi stadi di sviluppo. (A) zebrafish embrioni sono stati impiantati con un microbead (diametro di circa 50 micron) nel tronco in fase di germoglio di coda. Esaminato in 24 ore dopo branello impianto (hpbi), gli embrioni avevano sviluppato normalmente e la microbead mostrato minimo movimento durante il passaggio del tempo evolutivo. (B) zebrafish embrioni impiantati con microsfere (con un diametro di circa 50 micron) nel sacco vitellino nella fase 3 somite (ss) visualizzate sviluppo normale con movimento tallone relativamente minore nel tempo. (C) microsfere grandi (diametro di circa 70 micron) sono stati impiantati nell'embrione 7 ss simile mostrato successivo sviluppo normale, così come minimal se dal sito dell'impianto alcun movimento. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 4. sviluppo Gross dell'embrione zebrafish è imperturbato dalla presenza di un microbead attraverso 72 hpbi. Zebrafish embrioni sono stati impiantati con microsfere imbevute di soluzione di Ringer (con un diametro di circa 50 micron) nella fase 7 somite (ss). Ogni microperla stato chirurgicamente inserito nel bagagliaio, tra le somiti 3 e 4. La presenza del cordone non era associata a difetti palesi sviluppo a 24 ore dopo perlina impianto (hpbi), 48 hpbi, o 72 hpbi. Clicca qui per visualizzare un versione più grande di questa figura.

Discussion

Nel secolo scorso, la comprensione del piano corpo patterning e organogenesi ha subito progressi monumentali. Tecniche di manipolazione dei tessuti erano critici nello scoprire informazioni chiave su questi processi vitali. La modificazione genetica è uno dei metodi più comunemente utilizzati per l'accertamento funzione dei geni, e metodi di analisi mosaico, come il trapianto di cellule, fornisce approcci utili a comprendere l'autonomia della funzione del gene. Impianto microperla fornisce un altro luogo per interrogare come le molecole particolare alterare le dinamiche evolutive, in quanto questo metodo consente al ricercatore di alterare un ambiente del tessuto locale con l'introduzione di molecole di segnalazione o inibitori. Una gamma di microsfere sono disponibili in commercio, che hanno varie dimensioni e altre proprietà fisiche esistere (ad esempio, carica) tale che essi possono essere impiegati per le condizioni sperimentali di interesse. Così, impiantando microsfere che sono immersi in una proteina o chimicocal di interesse all'interno di un organismo, i ricercatori possono studiare gli effetti localizzati durante lo sviluppo e trovare le associazioni tra il gene o molecola di interesse e particolare fenotipo biologico (s).

Studi come quello eseguito da Wada e colleghi hanno utilizzato microperla l'impianto al fine di valutare l'effetto di un aumento Hedgehog in patterning scheletrico neurocranio anteriore (ANC) in zebrafish 23. Studi precedenti hanno dimostrato che Shh è necessario per la formazione ANC 14. Uso microsfere Shh rivestite ricercatori hanno identificato che questo segnale promuove la formazione della cartilagine nell'ANC. Il processo di impianto microperla è stato utilizzato per dimostrare un chiaro legame tra segnalazione Hedgehog e la formazione di cartilagine dell'ANC. Un altro esempio chiave di questa tecnica manipolazione dei tessuti in zebrafish è osservata in studi in cui gli scienziati hanno studiato il controllo trascrizionale del Erythroblastoma ventisei (ETS) dominio fmolecola attori ETS relative (Erm) e Polyoma enhancer attivatore 3 (Pea3) di FGF signaling durante le prime fasi di sviluppo del cervello zebrafish 19. Attraverso esperimenti di impianto microperla, sono stati in grado di dimostrare che Fgf8 e FGF3 possono ectopicamente attivare l'espressione di ERM e pea3. Questi esempi illustrano l'utilità di microsfere di fornire informazioni sui meccanismi di sviluppo che collaborano durante la formazione del tessuto, che possono essere ben caratterizzato dall'utilizzo di metodi per valutare l'espressione genica 41. Così, il trapianto microbead può essere un metodo praticabile per esplorare altri tessuti, come il mesoderma intermedio (IM) che dà origine al rene. In particolare, sarebbe di aiuto negli studi di sviluppo renale, per indagare come le diverse molecole influenzano nefrone segmentazione 42 e tubulogenesi 43,44, processi che sono solo superficialmente compresi attualmente. Inoltre, microbead impianto è già iniziato ad essere utilizzato al montanteprocessi y rigenerazione in zebrafish 29] e potrebbero essere adattati per l'utilizzo con qualsiasi numero di modelli di rigenerazione di organi, come ad esempio in seguito ablazione laser dei tessuti embrionali, come il nefrone 45 o in combinazione con metodi che sono stati formulati per eseguire la ricerca con le corrispondenti strutture per adulti 46-49. Infine, microbead impianto ha il potenziale per essere utilizzato in modelli di malattie umane, come il cancro 50,51 o tessuto degenerazione 52,53.

Nel presente protocollo, dimostriamo il metodo di microbead impianto in embrioni di zebrafish, che è anche stato simile descritto da altri ricercatori, ma non dimostrato, attraverso protocolli di video 1. Con la pratica minimo siamo stati in grado di impiantare microsfere ad una velocità di circa 8-10 embrioni / h, che mette in relazione la fattibilità di questa procedura una volta che il ricercatore ha una certa esperienza. I risultati riportati nel presente documento dimostrano che perle di vari dimensioni possono essere impiantati nelle fasi iniziali, e che con cura, questa tecnica manipolazione dei tessuti possono essere implementati con minimo impatto fisico per l'embrione. Un miglioramento che va sottolineato è l'uso di uno strumento basette / ciglia posizionarla microbead nell'embrione. Questo pezzo relativamente economico e semplice di apparecchiature è circa lo stesso diametro del microperla, è facile da ottenere e aiuta a velocizzare il processo di impianto. Il baffo / sferza può essere tagliato alla lunghezza desiderata per la produzione di una ditta e delicato strumento-tallone gestione, a seconda del ricercatore destrezza e la preferenza. Infine, mentre abbiamo descritto qui come manipolare fisicamente microsfere ed embrioni di zebrafish per eseguire l'impianto, questo protocollo non delineare specifiche procedure di gestione per i farmaci o peptidi diversi. In generale, microsfere trattate chimicamente devono essere impiantati nell'animale con espedienti, per evitare effetti indesiderati in altre aree dell'organismo, e ricercatori dovrebbero essere largoformata sui possibili problemi di sicurezza associati a tali sostanze chimiche prima di iniziare i loro studi.

In sintesi, abbiamo dimostrato un metodo microbead impianto relativamente semplice ed efficiente con una vasta gamma di applicazioni che utilizzano materiali che sono facilmente disponibili in laboratorio. In definitiva, ci auguriamo che questo manuale sarà di aiuto ai ricercatori la delicatezza di manipolazione dei tessuti zebrafish.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere DP2OD008470.

Materials

Sodium Chloride American Bioanalytical AB01915
Potassium Chloride American Bioanalytical AB01652
Calcium Chloride American Bioanalytical AB00366
HEPES Sigma Life Science H4034
Penicillin-Streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333-20ML
N-Phenylthiourea (PTU) Aldrich Chemistry P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricane) Fluka Analytical A5040
Borosilicate glass Sutter Instruments Co. BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Mo. P097
UltraPure Agarose Invitrogen 15510-027
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Methylene Blue Sigma-Aldrich M9140
250mL Erlenmeyer Flask Fischer Scientific FB-500-250
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile Corning 430167
60mm x 15mm VWR 25373-085
100mm x 15mm VWR 25373-100
150mm x 15mm VWR 25373-187
Saint-Gobain Chemware Microspatula Fischer Scientific 21-401-50B
P-1000 Micropipette tips Fischer Scientific 2707402
Low Temperature Incubator Fischer Scientific 11 690 516DQ
Dimethly Sulfoxide American Bioanalytical AB00435
Microbeads (45-106 µm) Biorad 140-1454 AG1-X8
Microbeads (45 µm) Polysciences 7314
Micro Dissecting Tweezer Roboz Surgical Instruments Co. RS-5010
Tungsten Needle Roboz Surgical Instruments Co. RS-6065
Capillary tube holder Globe Scientific Inc.  51674
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Picker, A., et al., Lieschke, G. J., et al. Tissue micromanipulation in zebrafish embryos. Zebrafish, Methods in Molecular Biology. 546, (2009).
  2. Wilson, J., Tucker, A. S. Fgf and Bmp signals repress the expression of Bapx1 in the mandibular mesenchyme and control the position of the developing jaw joint. Dev Biol. 266, 138-150 (2004).
  3. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  4. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
  5. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
  6. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  7. Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish. Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).
  8. Amsterdam, A., Hopkins, N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease. Trends Genet. 22, 473-478 (2006).
  9. Pickart, M. A., Klee, E. W. Zebrafish approaches enhance the translational research tackle box. Transl Res. 163, 65-78 (2014).
  10. Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. J Vis Exp. 89, e51708 (2014).
  11. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21, 48-64 (2011).
  12. Auer, T. O., Del Bene, F. CRISPR/Cas9 and TALEN-mediated knock-in approaches in zebrafish. Methods. 69, 142-150 (2014).
  13. Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 12965-12969 (2000).
  14. Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): A vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Res C Embryo Today. 93, e52063 (2011).
  15. Donahue, E. K., Wingert, R. A. A manual small molecule screen approaching high–throughput using zebrafish embryos. J Vis Exp. , 52063 (2014).
  16. Hyatt, G. A., Schmitt, E. A., Marsh-Armstrong, N., McCaffery, P., Dräger, U. C., Dowling, J. E. Retinoic acid establishes ventral retinal characteristics. Development. 122, 195-204 (1996).
  17. Picker, A., Brand, M. Fgf signals from a novel signaling center determine axial patterning of the prospective neural retina. Development. 132, 4951-4962 (2005).
  18. Reifers, F., Walsh, E. C., Leger, S., Stainier, D. Y. R., Brand, M. Induction and differentiation of the zebrafish heart requires fibroblast growth factor 8 (fgf8/acerebellar.). Development. 127, 225-235 (2000).
  19. Raible, F., Brand, M. Tight transcriptional control of the ETS domain factors Erm and Pea3 by Fgf signaling during early zebrafish development. Mech Dev. 107, 105-117 (2001).
  20. Reim, G., Brand, M. spiel-ohne-grenzen/pou2. mediates regional competence to respond to Fgf8 during zebrafish early neural development. Development. 129, 917-933 (2002).
  21. Jaszai, J., Reifers, F., Picker, A., Langenberg, T., Brand, M. Isthmus-to-midbrain transformation in the absence of midbrain-hindbrain organizer activity. Development. 130, 6611-6623 (2003).
  22. Hirati, Y., Okamoto, H. Canopy1, a novel regulator of FGF signaling around the midbrain-hindbrain boundary in zebrafish. Curr Biol. 16, 421-427 (2006).
  23. Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
  24. Abe, G., Ide, H., Tamura, K. Function of FGF signaling in the developmental process of the median fin fold in zebrafish. Dev Biol. 304, 355-366 (2007).
  25. Prykhozhij, S. V., Neumann, C. J. Distinct roles of Shh and Fgf signaling in regulating cell proliferation during zebrafish pectoral fin development. BMC Dev Biol. 8, 91 (2008).
  26. Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis controls spreading and effective signaling range of Fgf8 protein. Curr Biol. 14, 1834-1841 (2014).
  27. Hardt, S., et al. The Bmp gradient of the zebrafish gastrula guides migrating lateral cells by regulating cell-cell adhesion. Curr Biol. 17, 475-487 (2007).
  28. White, R. J., Nie, Q., Lander, A. D., Schilling, T. F. Complex regulation of cyp26a1 .creates a robust retinoic acid gradient in the zebrafish embryo. PLoS Biol. 5, e2522-e2523 (2007).
  29. Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
  30. Niswander, L., Jeffrey, S., Martin, G. R., Tickle, C. A positive feedback loop coordinates growth and patterning in the vertebrate limb. Nature. 371, 609-612 (1994).
  31. Laufer, E., Nelson, C. E., Johnson, R. L., Morgan, B. A., Tabin, C. Sonic hedgehog and Fgf-4 act through a signaling cascade and feedback loop to integrate growth and patterning of the developing limb bud. Cell. 79, 993-1003 (1994).
  32. Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. Local application of retinoic acid to the limb bud mimics the action of the polarizing region. Nature. 296, 564-566 (1982).
  33. Samarut, E., Fraher, D., Laudet, V., Gibert, Y. ZebRA: an overview of retinoic acid signaling during zebrafish development. Biochimica et Biophysica Acta. 1849, 73-83 (2015).
  34. Lengerke, C., et al. Interactions between Cdx genes and retinoic acid modulate early cardiogenesis. Dev Biol. 354, 134-142 (2011).
  35. Wingert, R. A., et al. The cdx and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  36. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  37. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 559-585 (2013).
  38. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom., and Notch signaling. Dev Biol. 386, 111-122 (2014).
  39. Cheng, C. N., Wingert, R. A. Nephron proximal tubule patterning and corpuscles of Stannius formation are regulated by the sim1a. transcription factor and retinoic acid in the zebrafish. Dev Biol. 399, 100-116 (2015).
  40. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  41. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. J Vis Exp. , e51604 (2014).
  42. Cheng, C. N., Wingert, R. A., Carver, E., Lessman, C. Chapter 9: Renal system development in the zebrafish: a basic nephrogenesis model. Zebrafish: Topics in Reproduction & Development. , (2014).
  43. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Zebrafish pronephros tubulogenesis and epithelial identity maintenance are reliant on the polarity proteins Prkc iota .and zeta. Dev Biol. 396, 183-200 (1016).
  44. McKee, R., Gerlach, G. F., Jou, J., Cheng, C. N., Wingert, R. A. Temporal and spatial expression of tight junction genes during zebrafish pronephros development. Gene Expr Patterns. 16, 104-113 (2014).
  45. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. , e2845 (2011).
  46. McCampbell, K. K., Wingert, R. A. New tides: using zebrafish to study renal regeneration. Transl Res. 163, 109-122 (2014).
  47. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. 54, e2839 (2011).
  48. McCampbell, K. K., Springer, K. N., Wingert, R. A. Analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. , e51644 (2014).
  49. McCampbell, K. K., Springer, K., Wingert, R. A. Atlas of cellular dynamics during zebrafish adult kidney regeneration. Stem Cells Int. In press, (2015).
  50. Lee, S. L., et al. Hypoxia-induced pathological angiogenesis mediates tumor cell dissemination, invasion, and metastasis in a zebrafish tumor model. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19485-19490 (2009).
  51. Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Prot. 5, 1911-1918 (2010).
  52. Cao, R., Jensen, L. D. E., Söll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3, e2748 (1371).
  53. Cao, Z., et al. Hypoxia-induced retinopathy model in adult zebrafish. Nat Prot. 5, 1903-1910 (2010).

Tags

Zebrafish发育生物学Disease ModelOrganogenesisMicrobead ImplantationSignaling MoleculesEmbryo

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (101), e52943, doi:10.3791/52943 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image