Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.
The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold.
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.
diafisarias defectos óseos masivos son un gran reto para el cirujano ortopédico. reemplazo óseo con injerto autólogo, actualmente considerado como el tratamiento de referencia, es limitada y se asocia con la morbilidad relacionada con la cosecha. Por estas razones, las construcciones de hueso de ingeniería tisular que combinan las células madre mesenquimales de la médula ósea con andamios osteoconductivas se han explorado como una alternativa para los autoinjertos en cirugía ortopédica.
Hasta la fecha, la mayoría de los estudios se han realizado en modelos animales clínicamente relevantes tales como perros, cerdos y ovejas 1-3, pero la evaluación preliminar de estas construcciones en, segmentaria, defectos óseos de tamaño crítico ortotópico en modelos de animales pequeños (como ratones) podría tener varias ventajas: (i) los gastos bajos, (ii) un gran número de animales pueden ser operados; (Iii) en contraste a los modelos animales de gran tamaño, homogeneidad de las cepas de ratón limita las variaciones individuales en la resorción andamio unand formación de hueso y; (Iv) que es más importante, la disponibilidad de anticuerpos específicos y los animales de genes orientados permitir la evaluación de los procesos biológicos implicados en la curación de hueso. Por último, pero no menos importante, el uso de cepas inmunodeficientes de ratones también permite estudios ya sea utilizando los injertos de células de origen humano sin respuestas inmunes adversas en ratones.
A pesar de las ventajas antes mencionadas, los modelos defecto óseo de diáfisis masivos en los ratones son escasos. La mayoría de estos modelos de uso de fijación de huesos con un clavo intramedular que llena la cavidad de la médula ósea (limitando así el volumen de material a ensayar) y también impide reproducibilidad al no proporcionar estabilidad rotacional y axial 2,4-7.
Los objetivos del presente estudio son: (i) que imita una situación de no-unión ósea clínica, para describir un tamaño crítico-reproducible, segmentaria, modelo de defecto femoral en ratones, que se estabiliza mediante osteosynth placa de bloqueo exacta y reproducibleESIS que proporciona un entorno biomecánico altamente estable 8-10; (Ii) para ilustrar la presente modelo con dos sustitutos óseos potenciales y para describir los análisis de formación de hueso que se podría utilizar.
Implantación ectópica de materiales y dispositivos relacionados en ratones-ortopédicos se realiza con frecuencia para evaluar el hueso que forma las capacidades de los diferentes andamios 13,14. Sin embargo existen diferencias importantes entre los modelos ectópicos y ortotópico, incluyendo factores de señalización osteogénico nativos e interacciones paracrinas con células formadoras de hueso huésped.
El presente estudio establece una gran segmental murino reproducible, de tamaño crítico defecto femoral (3,5 mm, aproximadamente el 20-25% de la longitud del fémur). Teniendo en cuenta el tamaño de dicho defecto y la estabilidad proporcionada por la placa de osteosíntesis resultante, este modelo imita el hueso atrófico no unión-clínicamente encontrado.
El período de tiempo después de la operación elegida en el presente estudio, está en línea con los ratones modelos sin unión descritos anteriormente, que muestra una falta de cicatrización adecuada después de 8 a 12 semanas 4,9,15,16.
Lo más importante, reproducible y estable de osteosíntesis, así como la estabilidad de los sustitutos óseos implantados se obtuvieron sin una significativa morbilidad y mortalidad 1,2 con el uso tanto de la placa de bloqueo y una plantilla para realizar la osteotomía. Este resultado contrasta también los resultados reportados cuando se utilizaron ya sea un fijador externo o un clavo intramedular 4,5,17-24. Para los fijadores externos desventajas potenciales incluyen: la variabilidad en la rigidez, las infecciones de las vías alfileres, aflojamiento de los pasadores, los potenciales de lesiones debido a los pasadores y el peso de los materiales (de 4 a 20% del peso corporal del ratón). Para el clavo intramedular desventajas potenciales incluyen: llenado de la cavidad medular con el clavo y el daño iatrogénico de las superficies articulares.
Otros segmentarias murino, de tamaño crítico defectos femorales estabilizadas por osteosíntesis placa se han descrito con defecto óseo creado por una rebaba y que van desde 1,5 a la longitud de 2 mm 16,25. en THe modelo actual, el uso de una plantilla y un hilo de sierra permite una osteotomía precisa 3,5 mm de largo sin músculos significativas trauma.
Sin embargo, para tener éxito en la realización del procedimiento se debe tener en cuenta varios puntos clave: No use los ratones pequeños (ratones Nude, ya sea con un peso de menos de 25 go edad de 8 semanas) de lo contrario la placa debe ser demasiado largo. Cuando se acerca el hueso femoral, tener cuidado de preservar tanto el nervio ciático en sentido caudal y la cápsula articular distal. Aplicar la placa en la parte anterior del hueso femoral y desde la alineación de la placa se determina mediante la aplicación de este primer tornillo, tener cuidado de colocar la placa en paralelo al fémur al insertar este primer tornillo.
Antes de realizar la osteotomía, tener cuidado de realizar una disección circular del fémur en la parte media de la diáfisis de evitar trauma muscular. Al realizar la osteotomía, ayudante del cirujano debe mantener firmemente la guía y el surGeon debe tener cuidado de (i) no enredar el hilo de sierra, (ii) utilizar el medio de dos tercios del alambre mientras se aplica una tensión constante constante, y (iii) para evitar el exceso de movimiento para obtener un corte de hueso recta.
curación ósea es posible en el presente modelo proporcionado se utiliza un injerto de hueso. Por otra parte, este modelo permite realizar más estudios sobre los mecanismos implicados en las estrategias de sustitución ósea cuando se utilizan injertos, ya sea de origen humano o células en un segmentaria, defecto bien estandarizada, grande, hueso.
Además, de acuerdo con las tendencias actuales que requieren refinamiento y reducción de la utilización de animales en la investigación relacionada con la ortopedia, este modelo puede ser utilizado en conjunción con técnicas de imagen in vivo, tales como bioluminiscencia. Tales técnicas no invasivas permiten monitorear tanto la supervivencia celular y la cicatrización de los tejidos implantados sin requerir el sacrificio de animales 26.
Las principales limitaciones de este modelo son tanto elcondiciones de carga y el volumen del defecto óseo creado porque no imitan completamente las encontradas clínicamente en seres humanos. Otras limitaciones del modelo son (i) la radio-opacidad de la placa que puede requerir la eliminación de la placa antes de ex vivo análisis μCT y puede complicar la interpretación de los resultados longitudinales examen radiográfico y, (ii) la incapacidad para modular la rigidez placa que puede ser un parámetro mecánico clave en la formación de hueso 27-30.
Hay que tener en cuenta también, cuando se utiliza isoinjerto hueso u otros andamios que contienen un componente mineral (especialmente carbonato de calcio), que algún sesgo se introducen en el proceso de segmentación del análisis de micro-CT, debido a la densidad del hueso recién formado, en parte se superponen con ya sea la densidad o densidad isoinjerto andamio. Por esta razón, el volumen de hueso obtener por el análisis de micro-CT mayoría reflejar el volumen de tejido mineralizado (hueso recién formado plussustituto óseo) 11,26,31.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer a Rena Bizios por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito.
α-MEM , Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich, France | M4526 | 500 ml |
Acropora sp. coral exoskeleton cubes, Biocoral® | Biocoral®, Inoteb, France | 3x3x3 mm cubes, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization | |
Buprenorphine, Buprecare® | Axience, Pantin, France | 0.3 mg/ml | |
Xylazine, Rompun® 2% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 20 mg/ml | |
Ketamine, Ketamine 500® | Virbac, Carros, France | 50 mg/ml | |
Isoflurane, Forène® | Abbott, Arcueil, France | ||
Enrofloxacine, Baytril® 5% | Bayer HealthCare, Puteaux, France | 50 mg/ml | |
Pentobarbital, Dolethal® | Vétoquinol, Lure, France | 182,2 mg/ml | |
Anesthetizing box | Ugo Basile, Gemonio, Italy | 7900/10 | |
Plastic transparent sterile drape, BusterOpCover 30*45cm | Buster, Coveto, Montagu, France | 613867 | |
10% povidone iodine, Vétédine® Solution | Vétoquinol, Lure, France | 100 mg/ml | |
Titanium micro- locking plate, MouseFix Plate XL | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.120 | 6 holes, 10 mm long and 1.5 mm wide, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
0.3 mm drill bit, Drill Bit 0.30 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.592.200 | autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Engine power | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | AccuPen | Cold sterilzation (ethylene oxide) |
Screw driver, Handrill | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.390.130 | autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Self-tapping locking screws, MouseFix Screw 2 mm | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.401.100 | 2 mm long, 0.47 mm outer diameter and 0.34 mm core diameter, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
Jig,MouseFix XL Drill and Saw Guide | RISystem AG, Davos, Switzerland, http://www.risystem.com/ | RIS.301.103 | 3.5 mm between the slots, autoclaving (121°C for 20 min) sterilization or cold sterilzation (ethylene oxide) |
0.22-mm Gigli saws (0.22 mm Saws) | RISystem AG, Davos, Switzerland | ||
5.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
4.0 glycomer 631, Biosyn | Covidien, Vétoquinol, Lure, France | Tapper-cut needle | |
Xray, MX20 | Faxitron X-ray Corp, Edimex, Le Plessis Grammorie | ||
in vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1176 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
Ex vivo high-resolution microcomputed tomography, Skyscan 1172 | Skyscan, Aartselaar, Belgium | ||
Resident software: Nrecon(v1.6.9)/Ctan(v.1.14.4) | Skyscan, Aartselaar, Belgium |