שיתוף immunoprecipitation של חלבון העכבר MX1 עם nucleoprotein וירוס השפעת

חלבוני התנגדות Myxovirus (MX) הם חלק חשוב של ההגנה החיסונית המולדת נגד פתוגנים נגיפיים. חלבונים אלה הם GTPases כמו dynamin-גדול הנגרמים על ידי הסוג I וסוג III אינטרפרונים. גני Mx המקבילים נמצאים כמעט בכל בעלי חוליות בעותקים אחד או מספר המוצרים והגן לעכב מגוון רחב של וירוסים, כולל Orthomyxoviridae (למשל., וירוס שפעת), Rhabdoviridae (למשל., וירוס stomatitis שלפוחי), Bunyaviridae (למשל. , וירוס LA CROSSE) וRetroviridae (למשל, וירוס כשל חיסוני אנושי-1) ^1-4. לא ברור כיצד חלבונים אלה להכיר מגוון רחב כל כך של וירוסים, ללא כל רצף ראשוני משותף לכאורה מוטיבים בוירוסים אלה. ניתוח האינטראקציה של חלבוני MX עם המטרות נגיפיות שלהם, שעלול להיות כרוכות במתחמים מסדר גבוהים יותר עם גורמי תא מארח אחרים, יעזור להבין את המנגנונים המולקולריים tכובע התפתח במרוץ החימוש בין וירוסים ומארחיהם.

האינטראקציה בין חלבוני Mx יונקים ומטרות נגיפיות נחקרה בצורה נרחבת ביותר לMXA האנושי. MXA האדם יכול לעכב את השכפול של וירוסים רבים, כוללים שפעת orthomyxoviruses ווירוס Thogoto. MXA נקשר מתחמי Thogoto ribonucleoprotein הווירוס (vRNPs), ובכך למנוע הכניסה הגרעינית שלהם, וכתוצאה מכך הבלוק של זיהום ^5. אינטראקציה זו בין vRNPs וירוס MXA וThogoto הודגמה בניסויי שיתוף שקיעה ושיתוף immunoprecipitation ^6-9. איך חלבוני Mx לעכב נגיפי שפעת הוא פחות ברור. אחת בעיות עיקריות הוא שזה לא פשוט להפגין אינטראקציה בין חלבון מושלם וזה מוצר גן השפעת. דו"ח אחד הפגין אינטראקציה בין MXA אדם וחלבון NP בשפעת תאים נגועים בוירוס ^10. אינטראקציה זו יכולה להיות מוצגת רק על ידי שיתוף immunoprecipitation אם טופלו התאים עם dithiobis cross-linking מגיב (propionate succinimidyl) לפני תמוגה, המצביע על כך האינטראקציה היא חולפת ו / או חלשה. מחקרים מאוחרים יותר הראו כי רגישות Mx ההפרש של זני שפעת שונים נקבעת על ידי המקור של חלבון NP ^11,12. בקנה אחד עם זו, נגיפי שפעת יכולים לברוח בחלק משליטת Mx על ידי מוטציה שאריות ספציפיות בחלבון NP ^13. הדבר מצביע על כך היעד העיקרי של וירוסי שפעת למארח MX הוא חלבון NP, ככל הנראה NP התאסף במתחמי vRNP. עם זאת, אף אחד מהמחקרים שנעשה לאחרונה הראה יותר אלה אינטראקציה בין השפעת NP או vRNPs וגם MXA אדם או לעכבר MX1.

לאחרונה הראו, בפעם הראשונה, אינטראקציה בין השפעת NP וחלבון MX1 עכבר עם פרוטוקול מותאם שיתוף immunoprecipitation ^14, שתואר כאן בהרחבה. בשיתוף i הכללית,mmunoprecipitation הוא אחת הגישות הנפוצות ביותר בשימוש ביוכימיים לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון. טכניקה זו לעתים קרובות עדיפה על טכניקות חלופיות, למשל, שמרי שתי היברידיים, שכן הוא מאפשר לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון בסביבתם הטבעית. Co-immunoprecipitation יכול להתבצע על חלבונים הביעו endogenously אם נוגדנים נגד חלבוני עניין זמינים. לחלופין, חלבוני עניין יכולים לבוא לידי ביטוי בתא דרך transfection או זיהום ותג זיקה ניתן להשתמש. בנוסף ליתרונות שהוזכר לעיל, פרוטוקול שיתוף immunoprecipitation המתואר מאפשר זיהוי של אינטראקציות חלבון חלשות ו / או חולפות. המרכיב העיקרי בפרוטוקול מותאם זה הוא התוספת של N-ethylmaleimide (Nem) במאגר תמוגה התא. Nem הוא מגיב אלקילציה שמגיבה עם קבוצות תיאול חופשיות כמו הווה בcysteines, בpH של 6.5-7.5, כדי ליצור thio-אסתר יציבה(איור 1). ב- pH גבוה יותר, nem יכול גם להגיב עם קבוצות אמינו או לעבור הידרוליזה ^15. Nem משמש בדרך כלל כדי לחסום קבוצות תיאול חופשיות, על מנת למנוע היווצרות קשר דיסולפיד או לעכב פעילות האנזימטית. לדוגמא, nem משמש לעתים קרובות כדי לחסום אנזימי desumoylating, אשר פרוטאזות ציסטאין. בפרוטוקול שיתוף immunoprecipitation תאר, nem תחילה כלול במאגר תמוגה משום שכבר דווחו כי sumoylation של חלבוני שפעת יכולה להשפיע על האינטראקציה בין חלבונים נגיפיים ^16. באופן בלתי צפוי, התוספת של nem הוכיחה להיות מפתח ללתעד את האינטראקציה בין השפעת NP ועכבר MX1 על ידי שיתוף immunoprecipitation. לא ברור מדוע התוספת של nem היא חיונית כדי לזהות את האינטראקציה NP-MX1. אולי האינטראקציה מדי חולפת ו / או חלשה. Nem יכול לייצב את האינטראקציה, למשל, על ידי שמירת קונפורמציה ספציפית של MX1, חלבון נגיפי או אפילו compo שלישי לא ידועnent. כגון השפעה מייצבת של nem נצפתה לפני, למשל, לאינטראקציה בין reductase ribonucleotide M1 וgemcitabine המעכב (F2dC) ^17. MX1 וNP שניהם מכילים שאריות ציסטאין מרובות אשר יכול להיות שונה על ידי nem. לדוגמא, מחקר שנערך לאחרונה על ידי רני et al. הוכיח כי stalkless MXA-variant מכיל שלוש שאריות ציסטאין נחשפו ממס שניתן לשנות על ידי iodoacetamide. מוטציה שאריות אלה לserines לא השפיעה על הפעילות האנזימטית של MXA, אבל מנעה צבירה בתיווך דיסולפיד ^18. כcysteines אלה נשמרים בMX1, זה מצביע על כך cysteines המקביל בMX1 ניתן לשנות על ידי nem וכקונפורמציה השפעה כזו או מסיסות. בנוסף, nem עשוי להשפיע גם על פעילות GTPase של MX1, שהוא חיוני לפעילות נגד השפעת של MX1, ובכך לייצב את יחסי הגומלין בין MX1 וNP. עם זאת, השפעה ישירה של nem על acti GTPasevity של MX1 הוא סביר, כnem נדרש גם כדי לזהות את יחסי הגומלין בין השפעת NP וGTPase מוטציות לא פעילה של חלבון MX1 ^14. ברור, יש צורך במחקר נוסף כדי לפענח את ההשפעה של nem על האינטראקציה NP-MX1.

לסיכום, פרוטוקול שיתוף immunoprecipitation המתואר מאפשר לחקור את האינטראקציה בין החלבונים אנטי MX1 והיעד הנגיפי שלה, חלבון NP שפעת. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לחקור אינטראקציות חלשות או חולפות אחרות שתלויים בייצוב של תצורות חלבון ספציפיות. אינטראקציה בין חלבונים התלויים בתצורות ספציפיות תוארה קודם לכן, למשל, למחייב חלבוני סידן כגון calmodulin ^19. לבסוף, התפקיד מועיל של nem יכול לשמש גם בשיטות אחרות המזהות חלבונים אינטראקציות, כגון מבחני שיתוף שקיעה.