Co-immunoprecipitatie van de Muis Mx1 eiwit met het influenza A-virus nucleoprotein

Myxovirus weerstand (Mx) eiwitten zijn een belangrijk onderdeel van de aangeboren afweer tegen virale ziekteverwekkers. Deze eiwitten zijn groot dynamin-achtige GTPases die worden geïnduceerd door type I en type III interferonen. De overeenkomstige Mx genen aanwezig in bijna alle gewervelde dieren in een of meerdere kopieën en hun genproducten remmen een groot aantal virussen, waaronder Orthomyxoviridae (bv., Influenzavirus), Rhabdoviridae (bijv., Vesiculaire stomatitis virus), Bunyaviridae (bijv. , La Crosse virus) en Retroviridae (bijvoorbeeld humaan immunodeficiëntievirus-1) ^4/1. Het is onduidelijk hoe deze eiwitten herkennen zo'n breed scala aan virussen, zonder duidelijke gedeeld primaire sequentie motieven in deze virussen. Het analyseren van de interactie van Mx-eiwitten met hun virale doelen, mogelijk met hogere orde complexen met andere gastheercel factoren, zal helpen om de moleculaire mechanismen te begrijpen thoed zijn geëvolueerd in de wapenwedloop tussen virussen en hun gastheren.

De interactie tussen zoogdieren Mx eiwitten en virale targets is het meest uitgebreid bestudeerd voor menselijke MxA. Menselijke MxA kan de replicatie van veel virussen, waaronder de orthomyxovirussen influenza A en Thogoto virus remmen. MxA bindt Thogoto virus ribonucleoproteïne complexen (vRNPs), waardoor hun nucleaire binnenkomst, waardoor blok infectie ⁵ voorkomen. Deze interactie tussen MxA en Thogoto virus vRNPs aangetoond met co-sedimentatie en co-immunoprecipitatie experimenten ^6-9. Hoe Mx eiwitten hinderen influenza A-virussen is minder duidelijk. Een groot probleem is dat het niet eenvoudig om een ​​interactie tussen een eiwit en Mx een influenza genproduct tonen. Een rapport toonde een interactie tussen mens MxA en de NP-eiwit in het influenza A-virus geïnfecteerde cellen ^10. Deze interactie kan alleen worden aangetoond door co-immunoprecipitation als de cellen waren behandeld met de verknopingsreagens dithiobis (succinimidylpropionaat) voor lysis, wat suggereert dat de interactie van voorbijgaande aard en / of zwak. Recentere studies hebben aangetoond dat de differentiële Mx gevoeligheid van verschillende influenza A-stammen wordt bepaald door de oorsprong van het NP-eiwit ^11,12. In lijn met deze, kan influenza-A-virussen deels ontsnappen uit Mx controle door het muteren van specifieke resten in het NP eiwit ^13. Dit suggereert dat de belangrijkste doelstelling van influenza A virussen gastheer Mx NP eiwit, waarschijnlijk NP geassembleerd vRNP complexen. Geen van deze recentere studies toonden een interactie tussen influenza NP of vRNPs en humaan MxA of muis Mx1.

Onlangs toonden wij voor het eerst een interactie tussen influenza NP en muis Mx1 eiwit met een geoptimaliseerde co-immunoprecipitatie protocol ^14, dat hier wordt beschreven. In het algemeen co-immunoprecipitation is een van de meest gebruikte biochemische methoden om proteïne-proteïne interacties te onderzoeken. Deze techniek wordt vaak de voorkeur boven andere technieken, bijvoorbeeld gist twee hybride, aangezien het eiwit-eiwit interacties in hun natuurlijke omgeving onderzoeken. Co-immunoprecipitatie kan op endogeen tot expressie gebrachte eiwitten worden uitgevoerd als antistoffen tegen de eiwitten van belang zijn beschikbaar. Alternatief kunnen de eiwitten van belang tot expressie worden gebracht in de cel door middel van transfectie of infectie en een affiniteit tag worden gebruikt. Naast de hierboven genoemde voordelen, beschreven co-immunoprecipitatie protocol maakt de detectie van zwakke en / of transiënte eiwit interacties. Het hoofdbestanddeel van deze geoptimaliseerde protocol is de toevoeging van N-ethylmaleimide (NEM) voor cel lysis buffer. NEM is een alkylerend reagens dat reageert met vrije thiolgroepen zoals aanwezig in cysteïnen bij een pH van 6.5-7.5, een stabiele thio-ester(Figuur 1). Bij hogere pH kan NEM ook reageren met aminogroepen of ondergaat hydrolyse ^15. NEM wordt typisch gebruikt om vrije thiolgroepen te blokkeren, teneinde vorming van disulfidebindingen te voorkomen of remmen enzymatische activiteit. Zo wordt NEM vaak gebruikt om desumoylating enzymen die cysteïne proteasen blokkeren. In het beschreven co-immunoprecipitatie protocol werd NEM eerst in het lysisbuffer, omdat was gemeld dat de sumoylation van influenza eiwitten interactie tussen virale eiwitten ¹⁶ kunnen beïnvloeden. Onverwacht toevoeging NEM gebleken om de interactie tussen influenza NP en muis Mx1 door co-immunoprecipitatie document. Het is onduidelijk waarom de toevoeging NEM is cruciaal voor de NP-Mx1 interactie detecteren. Mogelijk is de interactie is ook van voorbijgaande aard en / of zwak. NEM kon de interactie, bijvoorbeeld stabiliseren, door het behoud van een specifieke conformatie van Mx1, een viraal eiwit of zelfs een onbekende derde component. Een dergelijke stabiliserende effect NEM eerder is opgemerkt, bijvoorbeeld voor de interactie tussen de ribonucleotide reductase M1 en zijn inhibitor gemcitabine (F2dC) ^17. MX1 en NP beide bevatten meerdere cysteïneresiduen die door NEM kan worden gewijzigd. Bijvoorbeeld, een recente studie van Rennie et al. Aangetoond dat een stalkless MxA-variant bevat drie oplosmiddel cysteine ​​residuen die door iodoacetamide kan worden gewijzigd. Muteren deze residuen serinen heeft geen invloed op de enzymatische activiteit van MxA, maar voorkomen disulfide gemedieerde aggregatie ^18. Aangezien deze cysteïnen zijn geconserveerd in Mx1, suggereert dit dat de analoge cysteïnen in Mx1 door NEM en als zodanig beïnvloeden de conformatie of oplosbaarheid kan worden gewijzigd. Bovendien kan NEM van invloed op de GTPase activiteit van Mx1, die essentieel is voor de anti-influenza werking van Mx1 en daardoor de interactie tussen Mx1 en NP stabiliseren. Echter, een direct effect van NEM op de GTPase activiteit van Mx1 onwaarschijnlijk, zoals NEM moet ook de interactie tussen influenza NP en GTPase inactieve mutanten van het Mx1 eiwit ¹⁴ te detecteren. Het is duidelijk dat er meer onderzoek nodig is om het effect van NEM op de NP-Mx1 interactie te ontrafelen.

Samengevat, de beschreven co-immunoprecipitatie protocol kan de interactie tussen de antivirale Mx1 eiwit en virale doel, het influenza NP-eiwit te bestuderen. Dit protocol kan ook worden gebruikt om andere zwakke of voorbijgaande interacties die afhankelijk zijn van de stabilisatie van specifieke eiwitten conformaties bestuderen. Eiwit-eiwit interacties die door specifieke conformaties zijn eerder beschreven, bijvoorbeeld voor calcium bindende eiwitten zoals calmoduline ^19. Tenslotte, de gunstige rol NEM kan ook worden gebruikt in andere werkwijzen die eiwit-eiwit interacties, zoals co-sedimentatie assays detecteren.