Maternal Fetal Arayüz at Fare Dokular lökosit İzolasyonu
Summary
Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.
Abstract
Gebelikte immün tolerans annenin bağışıklık sistemi gelişmekte fetusun kabul ve beslemek için ayırt edici değişikliklere uğrar gerektirir. Bu hoşgörü, cinsel birleşme sırasında başlatılan döllenmenin ve implantasyon sırasında kurulan ve gebelik boyunca korunur. Maternal-fetal hoşgörü Aktif hücresel ve moleküler arabulucular plasenta ve uterus ve desidual dokuları içeren maternal-fetal arayüzü olarak bilinen fetal ve maternal dokular arasındaki temas yerinde zenginleştirilmiştir. Bu arayüz, stromal hücreleri ve infıltre edici lökositler oluşur ve bunların bolluğu ve fenotipik özellikleri gebelik boyunca değişir. Maternal fetal arayüzünde infiltre eden lökositlerin gebeliği ayakta yerel mikro-ortam yaratmak nötrofiller, makrofajlar, dendritik hücreler, mast hücreleri, T hücreleri, B hücreleri, NK hücreleri ve NKT hücrelerini içerir. Bu hücrelerin ya da herhangi bir inapprop arasındaki bir dengesizlikOnların fenotipleri de yaklaşımlarına yön değişiklik gebelikte hastalığın mekanizmasını kabul edilir. Bu nedenle, maternal-fetal arayüz sızmak lökositlerin çalışma gebeliğe bağlı komplikasyonlara neden bağışıklık mekanizmaları aydınlatmak için esastır. Burada tarif edilen bir proteolitik ve maternal-fetal arayüzünde fare dokulardan sızan lökositlerin izole etmek kolajenolitik enzimatik kokteyl ile sağlam enzimatik ayrıştırma ardından hafif mekanik ayrışma bir arada kullanan bir protokoldür. Bu protokol, yeterince korunmuş antijen ve fonksiyonel özelliklere sahip uygun bir lökosit (>% 70) yüksek sayıda izolasyon sağlar. İzole edilmiş lökositlerin daha sonra immunofenotip hücre sıralama, görüntüleme, immunoblotting, mRNA ekspresyonu, hücre kültürü, ve karışık bir lökosit reaksiyonları, proliferasyon, sitotoksisite veya tahlilleri gibi in vitro fonksiyonel deneyleri de dahil olmak üzere çeşitli teknikler ile analiz edilebilir.
Introduction
Ayırt edici değişiklikler annenin bağışıklık sisteminde ortaya çıktığında gebelik bağışıklık tolerans bir dönemdir. Bu değişiklikler anne fetus, yarı allojenik greft 1 tahammül sağlar. Fetus baba büyük doku uygunluk kompleksi (MHC) 2 antijenleri ve fetal hücreler anne dolaşımında 3 bulunmuştur ifade eder; Ancak, fetus, 4,5 vazgeçmiş değiliz. Bu muamma tam olarak anlaşılmış değildir.
En son hipotez maternal-fetal tolerans cinsel birleşme sırasında oluşturulan ve 6,7 döllenme ve tam süreli gebeliği 8-10 sürdürmek için muhafaza belirtiyor. Bu maternal-fetal tolerans dökümü gebeliğin 10-16 erken ve geç evrelerinde hastalık mekanizmasını kabul edilir. Maternal-fetal tolerans T hücreleri (düzenleyici T hücreleri, Th1 hücreleri, Th2 hücreleri ve Th17 hücreleri), mac dahil olmak üzere çeşitli lökosit alt popülasyonları, katılımını gerektirirrophages, nötrofiller, mast hücreleri, NK hücreleri, ve NKT hücreleri, dendritik hücreler ve B hücreleri, gebelik 15,17-19 boyunca yoğunluk ve lokalizasyon bu değişiklik. Annenin bağışıklık sistemi cenin antijenler 20,21 ile etkileşime anatomik sitede – Maternal-Fetal tolerans maternal-fetal arayüzü 20'de zenginleştirilmiştir.
Fetal extravillous trofoblastların rahim mukozası 22-24 istila ettiğinde maternal-fetal arayüz plasenta sırasında oluşturulur. Bu arayüz fetal tarafında, fetüsü çevreleyen zarlar plasenta içindeki özel bir epitel yüzey oluşturmak ve sinsityotrofoblast hücreleri anne kanındaki 22 ile doğrudan temas yoluyla besin alışverişini kontrol eder. Arayüzü maternal tarafında, Desidua farelerde bütün desidual hücrelerde% 50% 30'unu lökositlerin heterojen havuz işe. MATERN katılımları yanı sıraEl immun tolerans, bu hücrelerin gebelik sırasında farklı süreçler, örneğin., enfeksiyonlar, döllenmenin gelen üreme sisteminde korunması, embriyo implantasyonu 7,25, desidual anjiyogenez 26 vasküler remodeling 24,27, trofoblast invazyonu 28, plasental anahtar sebeplerindendir kalkınma 24,25 ve nihayetinde, emek ve dağıtım 15,17. Bu nedenle, maternal-fetal tolerans katılan lökositlerin çalışma gebeliğe bağlı komplikasyonların patogenezi aydınlatılması esastır.
Immünhistokimyasal ve immünofloresan kullanımı doğrudan görselleştirme ve uterin, desidual veya plasental lökositlerin 29,30 lokalizasyonu için veri üretti ederken, ayrıca bu dokuların 31,32 her lökositlerin belirli alt kümelerini ortaya çıkarmıştır sitometri analizi akış. Ayrıca, sitometri yoğunluğu ve mater oranını belirlemek için kullanılır olmuştur akışNAL fetal arayüz hücre dışı ve hücre içi proteinlerin 8-10,34 33 ve ekspresyon seviyelerini lökosit. Maternal-fetal arayüzünde lökositlerin sitometrik akış analizi tek bir hücre süspansiyonu gerektirir. Desidual, rahim ve plasenta dokularından süzücü lökositlerin izole etmek için, doku ayrışma için iki yöntem kullanılmıştır: mekanik ve enzimatik. Her iki yöntem de, bu dokuların hücre dışı matrisin (ECM) ile ilgili infiltre lökosit ayrılmasını sağlar. Daha az kesme kuvveti ile ilişkili hasar 35 ile lökositlerin yüksek verim verir gibi enzimatik doku ayrışma mekanik doku ayrılma üstündür. Sonuç olarak, mekanik doku ayrışma örnekleri değişkenliği ve heterojenitesini artırabilir dokuların 36, havuzlama gerektirir. Bununla birlikte, mekanik ayrıştırma İlgi konusu antigen enzimatik ayrışma veya değiştirilebilir zaman seçim olabilir hücre işleviFaiz ihtiyacı s korunacak (örn., NK hücrelerinin sitotoksisite) 35.
ECM aşağılamak özel enzimlerle proteoliz kullanımı mekanik ayrışma ile gözlenen düşük verim ortadan kaldırır. Çeşitli çalışmalar tripsin 32, kollajenaz 37, DNaz 31, 38 dispase ve çeşitli enzimlerin 32,39 ticari kokteyller kullanımını bildirmişlerdir. Bununla birlikte, doğal ve farklı enzim konsantrasyonu ve sindirim süresi titizlikle tanımlandığı gibidir ve immünofenotipleme için gerekli olan hücre yüzeyi antijenik epitopların bütünlüğünün korunmasını sağlamak için doğrulanması gerekir. Çeşitli yüzey yapıları bir çok monoklonal antikorlar tarafından tanınan lökosit yüzey epitoplarını sıyırma için ünlü olan tripsin gibi bazı enzimler ile, farklı enzimlerin yok farklı olarak duyarlı olan.
Bu tarifnamede sunulan bir proteolyt kullanılan bir yöntem olupAccutase denilen ic ve kolajenolitik enzimatik kokteyl. Bu enzimatik solüsyon kadar anne-fetal arayüzünde sıçangil hücreleri ayrıştırma sırasında halen etkin nazik ve ayrışma reaksiyonu sonlandırmak için başka ayrışan reaktifler veya serum eklenmesini gerektirmez. Ayrışma zamanı doğrulanması gerekiyor, ancak Ayrıca, yukarıda belirtilen enzimler 40,41 daha sağlamdır, tedarik edildiği gibi kullanıma hazırdır ve.
Doku ayrıştırma her iki tip bir kombinasyonunun kullanılması elde edilen hücrelerin kalitesi ve miktarı artırır; Böylece, çeşitli çalışmalar tatmin edici sonuçlar 31,32,37 ile mekanik ve enzimatik ayrılma kombine kullanımının hayata geçirdik. Burada tarif edilen bir protokol kurulmuş ve laboratuvarda doğrulandı; o sağlam enzimatik ayrıştırma ardından hafif bir mekanik ayrışma bir arada kullanır. Bu protokol izolasyonu ve daha fazla çalışma izin verirmaternal-fetal arayüzünde fare dokularda sızan lökositler (rahim, desidua ve plasenta). Akış sitometrik analizi ile gösterildiği gibi, aşağıdaki protokol aynı zamanda, hücre yüzey belirteçleri ve aşağı doğru uygulamalar için verim kadar canlı hücre bütünlüğünü korur. Son olarak, bu protokol analizi ve maternal-fetal arayüz oluşturan farklı fare dokuların karşılaştırma için hücre hazırlama tutarlılığını korumaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
maternal-fetal arayüzünde sızan lökositlerin bolluğu ve fenotipik özelliklerini kaydeden tutarlı veri toplanması gebelikle ilgili komplikasyonlar patogenezini anlamak için gereklidir. Çeşitli teknikler gebelik 31,38,39,43-46 boyunca anne-fetal arayüzünde Fare dokularından elde lökositlerin infiltre izolasyonunu kolaylaştırmak olduğu tarif edilmiştir. Ancak, her teknik farklıdır, her zaman izole hücrelerin canlılığını belirtmez, en önemlisi, enzimler veya enzim kombinasyonları fark…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NGL Anne, Perinatal ve Çocuk Sağlığı Wayne State Üniversitesi Perinatal Girişimi tarafından desteklenmiştir. Biz minnetle yazının eleştirel okuma Maureen McGerty ve Amy E. Furcron (Wayne State Üniversitesi) kabul eder.
Materials
| Magentic Cell Separation | |||
| MS Columns | |||
| Cell Separator | |||
| 30μm pre separation filters | |||
| Multistand | |||
| 15mL safe lock conical tubes | |||
| MACS Buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS) | ||
| Reagents | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 | |||
| Anti-mouse extracellular antibodies | (Table 1) | ||
| Sodium azide | |||
| Bovine serum albumin | (BSA) | ||
| LIVE/DEAD viability dye | |||
| Fixation buffer solution | |||
| FACS Buffer | (1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2) | ||
| Trypan Blue Solution 0.4% | |||
| Fetal bovine serum | |||
| Additional Instruments | |||
| Incubator with shaker | |||
| Flow cytometer | |||
| Centrifuge | |||
| Vacuum system | |||
| Incubator | |||
| Water bath | |||
| Cell counter | |||
| Microscope |
References
- Trowsdale, J., Betz, A. G. Mother’s little helpers: mechanisms of maternal-fetal tolerance. Nat Immunol. 7 (3), 241-246 (2006).
- King, A., et al. Evidence for the expression of HLAA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast. J Immunol. 156 (6), 2068-2076 (1996).
- Bonney, E. A., Matzinger, P. The maternal immune system’s interaction with circulating fetal cells. J Immunol. 158 (1), 40-47 (1997).
- Tafuri, A., Alferink, J., Moller, P., Hammerling, G. J., Arnold, B. T cell awareness of paternal alloantigens during pregnancy. Science. 270 (5236), 630-633 (1995).
- Chaouat, G., Petitbarat, M., Dubanchet, S., Rahmati, M., Ledee, N. Tolerance to the foetal allograft. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 624-636 (2010).
- Robertson, S. A., et al. Seminal fluid drives expansion of the CD4+CD25+ T regulatory cell pool and induces tolerance to paternal alloantigens in mice. Biol Reprod. 80 (5), 1036-1045 (2009).
- Robertson, S. A., Moldenhauer, L. M. Immunological determinants of implantation success. Int J Dev Biol. 58 (2-4), 205-217 (2014).
- Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
- Rowe, J. H., Ertelt, J. M., Xin, L., Way, S. S. Pregnancy imprints regulatory memory that sustains anergy to fetal antigen. Nature. 490 (7418), 102-106 (2012).
- Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
- Saito, S., Sakai, M., Sasaki, Y., Nakashima, A., Shiozaki, A. Inadequate tolerance induction may induce pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 30-39 (2007).
- Lee, J., et al. A signature of maternal anti-fetal rejection in spontaneous preterm birth: chronic chorioamnionitis, anti-human leukocyte antigen antibodies, and C4d. PLoS One. 6 (2), 0016806 (2011).
- Steinborn, A., et al. Pregnancy-associated diseases are characterized by the composition of the systemic regulatory T cell (Treg) pool with distinct subsets of Tregs. Clin Exp Immunol. 167 (1), 84-98 (2012).
- Gomez-Lopez, N., Laresgoiti-Servitje, E. T regulatory cells: regulating both term and preterm labor. Immunol Cell Biol. 90 (10), 919-920 (2012).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. 23 (10), 46 (2014).
- Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: one syndrome, many causes. Science. 345 (6198), 760-765 (2014).
- Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
- Timmons, B., Akins, M., Mahendroo, M. Cervical remodeling during pregnancy and parturition. Trends Endocrinol Metab. 21 (6), 353-361 (2010).
- Arck, P. C., Hecher, K. Fetomaternal immune cross-talk and its consequences for maternal and offspring’s health. Nat Med. 19 (5), 548-556 (2013).
- Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
- Wambach, C. M., Patel, S. N., Kahn, D. A. Maternal and fetal factors that contribute to the localization of T regulatory cells during pregnancy. Am J Reprod Immunol. 71 (5), 391-400 (2014).
- Cross, J. C., Werb, Z., Fisher, S. J. Implantation and the placenta: key pieces of the development puzzle. Science. 266 (5190), 1508-1518 (1994).
- Georgiades, P., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Comparative developmental anatomy of the murine and human definitive placentae. Placenta. 23 (1), 3-19 (2002).
- Croy, B. A., et al. Imaging of vascular development in early mouse decidua and its association with leukocytes and trophoblasts. Biol Reprod. 87 (5), (2012).
- Hofmann, A. P., Gerber, S. A., Croy, B. A. Uterine natural killer cells pace early development of mouse decidua basalis. Mol Hum Reprod. 20 (1), 66-76 (2014).
- Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy, B. Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
- Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
- Lash, G. E., et al. Regulation of extravillous trophoblast invasion by uterine natural killer cells is dependent on gestational age. Hum Reprod. 25 (5), 1137-1145 (2010).
- Kruse, A., Merchant, M. J., Hallmann, R., Butcher, E. C. Evidence of specialized leukocyte-vascular homing interactions at the maternal/fetal interface. Eur J Immunol. 29 (4), 1116-1126 (1999).
- Degaki, K. Y., Chen, Z., Yamada, A. T., Croy, B. A. Delta-like ligand (DLL)1 expression in early mouse decidua and its localization to uterine natural killer cells. PLoS One. 7 (12), 28 (2012).
- Habbeddine, M., Verbeke, P., Karaz, S., Bobe, P., Kanellopoulos-Langevin, C. Leukocyte Population Dynamics and Detection of IL-9 as a Major Cytokine at the Mouse Fetal-Maternal Interface. PLoS One. 9 (9), (2014).
- Blaisdell, A., Erlbacher, E., Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. Ch. 53. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. , 619-635 (2014).
- Rinaldi, S. F., Catalano, R. D., Wade, J., Rossi, A. G., Norman, J. E. Decidual neutrophil infiltration is not required for preterm birth in a mouse model of infection-induced preterm labor. J Immunol. 192 (5), 2315-2325 (2014).
- Plaks, V., et al. Uterine DCs are crucial for decidua formation during embryo implantation in mice. J Clin Invest. 118 (12), 3954-3965 (2008).
- Parr, E. L., Szary, A., Parr, M. B. Measurement of natural killer activity and target cell binding by mouse metrial gland cells isolated by enzymic or mechanical methods. J Reprod Fertil. 88 (1), 283-294 (1990).
- Arck, P. C., et al. Murine T cell determination of pregnancy outcome. Cell Immunol. 196 (2), 71-79 (1999).
- Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. 7 (7), 1-11 (2012).
- Li, L. P., Fang, Y. C., Dong, G. F., Lin, Y., Saito, S. Depletion of invariant NKT cells reduces inflammation-induced preterm delivery in mice. J Immunol. 188 (9), 4681-4689 (2012).
- Collins, M. K., Tay, C. S., Erlebacher, A. Dendritic cell entrapment within the pregnant uterus inhibits immune surveillance of the maternal/fetal interface in mice. J Clin Invest. 119 (7), 2062-2073 (2009).
- Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
- Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
- Pang, S. C., Janzen-Pang, J., Tse, Y., Croy, B. A., Yamada, A. T., Croy, B. A., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. Ch. 2. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy. , 21-42 (2014).
- Zenclussen, A. C., et al. Murine abortion is associated with enhanced interleukin-6 levels at the feto-maternal interface. Cytokine. 24 (4), 150-160 (2003).
- Mallidi, T. V., Craig, L. E., Schloemann, S. R., Riley, J. K. Murine endometrial and decidual NK1.1+ natural killer cells display a B220+CD11c+ cell surface phenotype. Biol Reprod. 81 (2), 310-318 (2009).
- Addio, F., et al. The link between the PDL1 costimulatory pathway and Th17 in fetomaternal tolerance. J Immunol. 187 (9), 4530-4541 (2011).
- Shynlova, O., et al. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. J Cell Mol Med. 17 (2), 311-324 (2013).
- Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
- Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
- Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).
- Gordon, K. M., Duckett, L., Daul, B., Petrie, H. T. A simple method for detecting up to five immunofluorescent parameters together with DNA staining for cell cycle or viability on a benchtop flow cytometer. J Immunol Methods. 275 (1-2), 113-121 (2003).
