הדמיה חיה של צילה Ependymal בחדרים לרוחב של מוח העכבר
Summary
באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC), תצפית vivo לשעבר של המכות של cilia ependymal ניע ממוקם בתוך החדרים במוח העכבר באה לידי ביטוי בחי הדמיה. הטכניקה מאפשרת הקלטה של תדר מכות הריסים הייחודי וזווית מכות וכן נכסי צעדה תנודת סידן תוך תאי שלהם.
Abstract
תאי ependymal Multiciliated שורת חדרי הלב במוח הבוגר. פונקציה או מבנה של cilia ependymal חריגים קשור עם גירעונות נוירולוגיות שונים. הדמיה החיה vivo לשעבר של טכניקת cilia ependymal ניע הנוכחי מאפשר למחקר מפורט של דינמיקת הריסים לאחר מספר צעדים. צעדים אלה כוללים: עכברי המתת חסד עם פחמן דו חמצני על פי פרוטוקולים של האוניברסיטה המוסדית הטיפול בבעלי חיים של טולדו וועדת שימוש (IACUC); craniectomy ואחריו הסרת מוח ונתיחת מוח sagittal עם vibratome או להב חד להשיג חלקים דקים מאוד בחדרים לרוחב המוח, שבו cilia ependymal ניתן דמיינו. דגירה של פרוסות של המוח בצלחת זכוכית תחתונה מותאמת אישית המכילה בינוני של הנשר (DMEM) / גבוהה גלוקוז השתנה Dulbecco על 37 מעלות צלזיוס בנוכחות של 95% O / 5% 2 / CO תערובת 2 היא חיונית כדי לשמור על רקמת חיים במהלךהניסוי. וידאו של מכות cilia אז נרשם באמצעות מיקרוסקופ התערבות ההפרש לעומת זאת ברזולוציה גבוהה. הווידאו לאחר מכן נותח על ידי מסגרת מסגרת לחשב את תדירות פעימות הריסים. זה מאפשר סיווג שונה של תאי ependymal לשלוש קטגוריות או סוגים מבוססים על התדירות וזווית מכות הריסים שלהם. יתר על כן, טכניקה זו מאפשרת שימוש בניתוח הדמיה הקרינה במהירות גבוהה כדי לאפיין את המאפיינים הייחודיים תאיים תנודת סיד של תאי ependymal כמו גם את ההשפעה של סוכנים תרופתיים על תנודות סידן ותדירות מכות הריסים. בנוסף, טכניקה זו היא מתאימה להדמיה immunofluorescence ללימודי מבנה הריסים ולוקליזציה חלבון הריסים. הדבר חשוב במיוחד במחקרי אבחון המחלה ופנוטיפ. המגבלה העיקרית של הטכניקה מיוחסת לירידה בתנועת ריסי ניע לחיות כמו רקמת המוח מתחילה למות.
Introduction
Cilia הם אברונים המבוסס על microtubule חושיים הנמשכים מתא השטח לסביבה תאית. בהתאם לארגון microtubule, cilia יכול להיות מסווג לשני סוגים – "9 + 0" או "9 + 2". מבחינה תפקודית, המבוסס על התנועה שלהם, אלה יכולים להיות מסווגים כריסי ניע או אי-ניע 1. cilia העיקרי הוא מונח נפוץ לציון "9 + 0" cilia לא ניע. אלה שיש לי תשעה microtubules מקביל כפיל (כונה על ידי '9') וזוג microtubules מרכזי נעדר בתוך הנדן המרכזי (כונה על ידי '0'). עם זאת, כמה ריסי "9 + 0", כגון cilia קטרי, המסדירים בין צדדים, עובר הם ניעתי 2. מצד השני, cilia ניע מתאפיינים, בנוסף לתשע כפילויות microtubule המקבילות, על ידי זוג מרכזי נוסף של כפילויות microtubule וקשורות לחלבוני מנוע dynein כדי להקל על תנועתיות. בנוסף, כמה "9+2 "Cilia כגון cilia חוש הריח הוא לא ניע 3. תאים המצפים את Ependymal חדרים במוח והתעלה של חוט השדרה המרכזית מאופיינים בריסי ניע המניעים את הנוזל השדרתי (CSF) לאורך 4 חדרים במוח.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא להקל לומדת את דינמיקת cilia ומומים מבניים ניע. בריאות המוח ופיתוח תלויה במידה רבה על זרימה יעילה של CSF בתוך החדרים במוח. לדוגמא, זרימת CSF רגילה ומאזן נוזלים דורשים מכות רגילות וcilia הפונקציונלי ependymal 5,6, אשר בתורו לשחק תפקידים קריטיים בויסות התנועה כיוונית של תאים עצביים ותאי גזע הגירת 7. ככזה, תפקוד לא תקין ependymal cilia או מבנה יכול להוביל לזרימת CSF חריגה, אשר מזוהה עם הידרוצפלוס, מצב רפואי שבו יש הצטברות חריגה של CSF בחדרי הלב של bגשם. זה עשוי כתוצאה מכך לגרום להגברת לחץ תוך גולגולתי וגדלה הדרגתית של הראש, עווית, ראיית מנהרה, ונכות נפשית 8.
היתרונות של שיטה זו על פני שיטות קיימות הוא שזה אפשר בפעם הראשונה לדווח שלושה סוגי תאים שונים ependymal: I, II ו- III, המבוסס על התדר שלהם ייחודי מכות הריסים ולהכות זווית. תאי ependymal אלה מקומיים באזורים מסוימים בחדרים במוח. יתר על כן, את ההשפעות של גיל וסוכנים תרופתיים כגון אלכוהול וcilostazol על שינוי סוגי תאי ependymal או המגויר ניתן להדגים, שלא היה אפשרי לפני סיווג זה של תאי ependymal. Cilostazol הוא מעכב של phosphodiesterase-3, אנזים שחילוף חומרי cAMP לAMP וזה גם מסדיר סידן תוך תאי 9. באמצעות ניתוח הדמיה הקרינה במהירות גבוהה מאפשר הדמיה וכימות של תאית הייחודימאפייני תנודת סידן של תאי ependymal. לדוגמא, האלכוהול וcilostazol שינו באופן משמעותי את תדירות ependymal מכות הריסים כמו גם את מאפייני תנודות סידן תוך תאי, אשר בתורו, יכול להוביל לשינוי בהחלפת נפח הנוזל השדרתי ידי cilia ependymal 10. לסיכום, טכניקה זו הייתה מפתח כדי לספק את העדות הראשונה משלושה סוגים שונים של תאי ependymal עם מאפייני תנודת סידן שונים.
בסעיף הבא, סקירת צעד-אחר-צעד מפורטת של ההליך מסופקת, הקדשת תשומת לב להכנה וטיפול ברקמות.
Protocol
Representative Results
Discussion
שתואר כאן הוא פרוטוקול להכנת רקמת מוח עכבר עבור שתי חיות-הדמיה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי המספק תצפית קרובה מהירה ורגישה של cilia ependymal בתוך החדרים במוח. טכניקה זו אינה מוגבלת לחדר לרוחב בלבד; זה יכול להיות מנוצל כדי לבחון את הריסים בחדרים במוח אחרים. טכניקת הדמיה זה מספקת ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Charisse Montgomery for her editing service. A. Alomran’s work partially fulfills the requirements for a master’s degree in Pharmacology.This work is funded by The University of Toledo’s intramural startup fund for W.A.A and NIH grant (DK080640) for S.M.N.
Materials
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18×18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24x60mm | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
References
- AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors. Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).
- Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
- Satir, P., Christensen, S. T. Overview of structure and function of mammalian cilia. Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).
- Delbigio, M. R. The ependyma – a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid. Glia. 14 (1), 1-13 (1995).
- Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors. Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).
- Appelbe, O. K., et al. Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus. Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).
- Sawamoto, K., et al. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.). Science. 311 (5761), 629-632 (2006).
- Banizs, B., et al. Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus. Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).
- Kawanabe, Y., et al. Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation. PloS one. 7 (9), e44476 (2012).
- Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties. J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).
- Chilvers, M. A., O’Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
- Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors. Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation. Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).
- Praetorius, H. A., Spring, K. R. Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium. The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).
- Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O’Callaghan, C. The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency. Cilia. 2 (1), 5 (2013).
