無血清単層培養中のマウス胚性幹細胞の神経分化

胚性幹細胞（キメラを形成することによって）適切な段階の胚に再導入後のすべての成体細胞型に分化する能力を保持しながら、in vitroで無限に増殖する能力を有する初期胚から誘導された多能性細胞、同系または免疫無防備状態の宿主に注入されています適切な手がかりに（奇形腫を形成することにより）、またはインビトロ 、対象における ^1。神経系統へのマウス胚性幹細胞のin vitroでの分化は、1995年に初めて記載され、モルフォゲン、レチノイン酸^2-4を補った血清含有培地中の多細胞懸濁凝集体（胚様体に、EB）の形成を関与していました。それ以来、種々のプロトコルは、神経分化^5を可能にするために開発されてきました。まだ凝集を利用する多くの、他の細胞型を誘導するとの共培養を、いくつかの無血清培地の使用を含みます。すべてのプロトコルの利点持っていますND欠点及び神経または神経細胞の正確な性質は、また、使用するプロトコルに応じて変化する生じました。

理想的なプロトコルは、堅牢で拡張性の高い、完全に定義された培地と基質を利用する、分化過程の非侵襲的モニタリングに適して、外部の手がかりによってパターニングすることができる神経前駆細胞の純粋な集団の生成をもたらすと区別するためであろう比較的短時間で高効率と収率で、すべてのニューロンとグリアサブタイプに。最後の十年では、低密度、無血清の接着性単層培養^6-10にマウスESCから神経前駆細胞と神経細胞を生成するための方法を使用しています。このプロトコルは、上述した多くの基準を満たす：我々の手に分化効率は、長年にわたって非常に一貫しており、種々の細胞株は、スケールアップすることができ、またはダウン（我々が正常に96ウェルプレートから容器を用います直径15cmジシーズ）と使用するメディアは、明確に定義されています。プロセスは、（ドーパミン作動性ニューロン⁶のために、例えば、ShhのとFGF8）ニューロンのサブタイプの別個の種類の生成を誘導するために添加することができる分化のモニタリングおよびパターニング手がかりの様々なタイムラプス顕微鏡に適しています。

それにもかかわらず、このプロトコルの成功のアプリケーションにはいくつかの課題があります。重要な側面の一つは、メディアの入念な準備です。我々は常に商業選択肢の利用可能性にもかかわらず、社内メディアを準備します。使用サプリメントの一つ（N2; プロトコルを参照）は、標準的な市販のバージョンに比べて変更されています。最後に、この方法の成功した適用のために最も重要なステップの一つは、めっきに最適な細胞密度です。誘導信号（FGF4 ^11）のいずれかの自己分泌性質が最適viabilを可能にするのに十分な細胞が存在することを必要とするので、これは主に高すぎる密度分化における性と分化は、（おそらくLIF ¹²の自己分泌産生に起因する部分で）損なわれています。これは、培地調製および細胞のプレーティングの両方が最適な結果を保証するために慎重にかつ一貫して行われることが重要です。