Différenciation neurale des souris de cellules souches embryonnaires dans le sérum sans culture monocouche
Summary
This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.
Abstract
La capacité à différencier les cellules souches embryonnaires de souris (ESC) pour progéniteurs neuronaux, permet l'étude des mécanismes de contrôle de la spécification de neurones ainsi que la génération de types de cellules neurales matures pour complément d'étude. Dans ce protocole, nous décrivons un procédé pour la différenciation de cellules progénitrices neurales ESC à l'aide de la culture en monocouche sans sérum. Le procédé est évolutive, efficace et aboutit à la production de ~ 70% de cellules progénitrices neurales à l'intérieur de 4-6 jours. Il peut être appliqué à l'ESC de diverses souches cultivées dans une variété de conditions. Progéniteurs neuronaux peuvent être autorisés à différencier en neurones fonctionnels et cellules gliales ou analysés par microscopie, cytométrie en flux ou moléculaires techniques. Le processus de différenciation est prête à la microscopie time-lapse et peut être combiné avec l'utilisation de lignes de rapporteurs pour surveiller le processus de spécification de neurones. Nous fournissons des instructions détaillées sur la préparation des milieux et de l'optimisation de la densité des cellules pour permettre au processus à be appliquée à la plupart des lignées de CSE et une variété de récipients de culture cellulaire.
Introduction
Les cellules souches embryonnaires sont des cellules pluripotentes dérivées de l'embryon précoce ayant la capacité de proliférer indéfiniment in vitro, tout en conservant la capacité de se différencier en tous les types cellulaires adulte suivantes réintroduction dans un embryon au stade approprié (par formation d'une chimère), l'injection dans syngéniques ou immunodéprimés hôtes (en formant un tératome) ou in vitro soumis à des indices appropriés 1. La différenciation in vitro de souris des cellules souches embryonnaires dans des lignées neurales a été décrite la première fois en 1995 et a impliqué la formation d'agrégats multicellulaires de suspension (corps embryoïdes, EB) dans des milieux contenant du sérum supplémenté avec de l'acide rétinoïque morphogène 2-4. Depuis lors, un grand nombre de protocoles ont été développés pour permettre la différenciation de neurones 5. Beaucoup utilisent encore l'agrégation, d'autres co-culture avec induisant types de cellules et plusieurs impliquent l'utilisation de milieux sans sérum. Tous les protocoles ont des avantages d'une inconvénients et la nature précise des neurones ou des cellules neuronales produites varie également selon le protocole utilisé.
Le protocole idéal serait robuste, évolutive et faire usage des médias et des substrats entièrement définis, se prêter à la surveillance non invasive du processus de différenciation et entraîner la génération de populations pures de progéniteurs neuronaux pouvant être modelée par des indices externes et de différencier dans tous les sous-types neuronales et gliales avec une grande efficacité et le rendement dans un temps relativement court. Dans les douze dernières années, nous avons utilisé une méthode pour générer des progéniteurs neuronaux et les neurones de souris ESC dans une faible densité, la culture de monocouche adhérente sans sérum 6-10. Ce protocole répond à la plupart des critères énoncés ci-dessus: dans nos mains l'efficacité de la différenciation a été assez constante au cours de nombreuses années et une variété de lignées cellulaires, il peut être agrandie ou réduite (nous utilisons avec succès les navires des plaques à 96 puits à 15 cm de diamètre dishes) et les supports utilisés sont bien définis. Le procédé se prête à la microscopie Timelapse pour le contrôle de la différenciation et une variété de structuration indices peuvent être ajoutés pour induire la production de différents types de sous-types de neurones (par exemple, Shh et Fgf8 pour les neurones dopaminergiques 6).
Néanmoins, il ya des défis à l'application réussie de ce protocole. Un des aspects clés est une préparation minutieuse des médias. Nous préparons toujours les médias en interne malgré la disponibilité d'alternatives commerciales. Un des suppléments utilisés (N2; voir le protocole) a plus de modifications à la norme de versions disponibles dans le commerce. Enfin, l'une des étapes les plus importantes pour l'application réussie de cette méthode est la densité cellulaire optimale au placage. Ceci est principalement parce que tandis que la nature autocrine de l'un des signaux induisant (FGF4 11) exige que suffisamment de cellules sont présents pour permettre VIABIL optimalelité et la différenciation, à la différenciation trop élevées des densités de dépréciation (éventuellement en partie due à la production autocrine de FRV 12). Il est donc important que la préparation des deux médias et le placage de cellules sont réalisées avec soin et de manière cohérente afin de garantir des résultats optimaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole de différenciation neurale monocouche a été en usage depuis plus d'une décennie 6. Le protocole est très efficace, composée d'un milieu défini, et fait dans un système de monocouche qui rend le système plus applicable pour préclinique (par exemple, le criblage de médicaments) utilise. Toutefois, il existe certains facteurs critiques qui déterminent l'efficacité de différenciation. Cet article souligne les facteurs et la solution pour chaque obstacle.
<p clas…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.
Materials
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-074 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| B-27 Supplement, serum free | Life Technologies | 17504-044 | |
| Insulin | Sigma | I6634 | Reconstitute with sterile 0.01M HCl |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | Reconstitute with sterile water |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Reconstitute with ethanol |
| Putrescine | Sigma | P5780 | Reconstitute with sterile water |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | Reconstitute with sterile water |
| Bovine albumin fraction V | Life Technologies | 15260-037 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented |
| Gelatine | Sigma | G1890 | |
| 6-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 140675 | |
| 24-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 142475 | |
| 96-well tissue culture dish | Thermo Scientific | 167008 | |
| GMEM | Life Technologies | 11710-035 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| MEM Non-essential amino acids solution | Life Technologies | 11140-050 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Leukaemia inhibitory factor | prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Protect from light |
| Mouse anti betaIII tubulin IgG antibody | Covance | MMS-435P | |
| Fluorescence-labelled anti-Mouse IgG antibody | Life Technologies | A31571 | Protect from light |
| 25cm2 tissue culture flask | Thermo Scientific | 156367 | |
References
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