Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad
Summary
There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.
Abstract
Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies.
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.
Introduction
La generación de memoria inmunológica en ausencia de enfermedad es la base fisiológica de la vacunación eficiente 1. Recientemente, los sistemas de enfoques basados en la biología han revelado que las vacunas exitosas, como la vacuna contra la fiebre amarilla, inducen una fuerte inducción de la respuesta inmune innata y la activación de varios subconjuntos de células dendríticas (DC), que a su vez, conducen a la activación del antígeno multilinaje células T específicas 2,3. Desde los DC son la única población de células inmunes con la capacidad de activar las células T vírgenes de antígenos específicos de 4, el estudio de su función durante la vacunación es fundamental para entender la respuesta inmune a las vacunas y diseñar estrategias de futuro frente a patógenos desafiantes.
Un sistema que permita el seguimiento de diferentes subconjuntos DCs durante las respuestas inmunes a las vacunas sería deseable con el fin de establecer una cinética precisos de la migración DC a los tejidos linfoides, y por lo tanto para proporcionarinformación sobre los mecanismos fisiológicos responsables de la iniciación de la inmunidad adaptativa-vacuna específica. Genética basada inversas enfoques ofrecen la posibilidad de generar modificado, las vacunas vivas atenuadas que se pueden utilizar experimentalmente con este propósito. Desde su puesta en práctica en la investigación de la gripe, la genética inversa basada en plásmidos se ha empleado ampliamente para generar cepas de la gripe recombinantes incluyendo LAIVs. Los protocolos estándar para rescatar virus de la gripe recombinantes requieren multi-transfección de líneas celulares altamente transfectables con plásmidos ambisense (produciendo tanto ARN de sentido positivo y negativo) que contienen los segmentos virales de la influenza ocho, así como la amplificación en un sistema permisivo tal como Madin-Darby de riñón canino ( células MDCK) y / o de pollo huevos embrionados 5. Sin embargo, la aplicación de genética inversa para generar herramientas moleculares con el fin de estudiar los mecanismos inmunes de la vacunación permanece sin explorar.
La generaciónde nuevos modelos de ratón que permite el agotamiento específico de subconjuntos de células inmunes, incluyendo las DC, ha abierto nuevas posibilidades para comprender los mecanismos inmunológicos básicos subyacentes protección de la vacuna-suscitó. La comparación entre las funciones de subconjuntos de DC en ratones y seres humanos ha revelado que, en gran medida, ratón y humanos DCs son funcionalmente homóloga 6,7, estos hallazgos, fuertemente sugieren que el desarrollo de modelos de ratón que permite el agotamiento específico de DCs en el estado estacionario y durante condiciones inflamatorias, puede servir para entender la fisiología de las respuestas de CC en los seres humanos. En los últimos años una serie de modelos de ratones se han generado que llevan transgenes que expresan el receptor de la toxina de la difteria de simio (DT) (DTR) bajo el control de la región promotora de un gen de interés 8,9. Desde tejidos de ratón no expresan naturalmente DTR, estos modelos permiten el agotamiento condicional de subconjuntos de células que portan el gen diana de interés sobre la inoculación al ratón con DT. Por lo tanto, nuestra ability para agotar DCs específicos y otros leucocitos en vivo durante los procesos fisiológicos, se ha mejorado en gran medida por el desarrollo de ro a base de DTR. Sin embargo, mientras que estos modelos de ratones transgénicos se han utilizado ampliamente para entender la ontogenia del sistema inmune, su aplicación para el desarrollo de vacunas ha sido apenas probado. Aquí, mediante la combinación de genética inversa de la gripe y quimeras de médula ósea competitivos basados-DTR, proponemos un método para estudiar la cinética de la inmunidad de la vacuna, así como la función del gen individual durante la respuesta inmune a las vacunas en vivo. La aplicación de esta tecnología para la evaluación preclínica de nuevas vacunas contra enfermedades infecciosas desafiantes podría ayudar a racionalizar el diseño de vacunas y probar vacunas candidatas en vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio se describe cómo la genética y modelos de ratones quiméricos inversa puede ser utilizado para dilucidar los mecanismos fisiológicos y moleculares de la inmunidad inducida por la vacuna. Genética inversa influenza se establece en muchos laboratorios y ha jugado un papel principal en la comprensión de la patogénesis de la gripe, la replicación y la transmisión 17. Un punto clave en nuestro protocolo es el rescate de las vacunas antigripales adaptadas al frío que expresan epítopos extr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sergio Gómez-Medina for excellent technical support with mouse experiments. This work was supported by funds from the Leibniz Association and the Leibniz Center of Infection. A.L. is a recipient of a pre-doctoral fellowship from the Leibniz Graduate School.
Materials
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1X) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| Opti MEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1X) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10X | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
References
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