JoVE Journal > Immunology and Infection
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Abstract
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免疫与感染

Analyse des fonctions des mastocytes in vivo à l’aide de sourisknock-inde mastocytes

Published: May 27, 2015
doi:
10.3791/52753
, , , , ,
1Department of Pathology,Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology,Stanford University School of Medicine

Summary

Nous décrivons une méthode pour la génération des mastocytes dérivés in vitro, leur greffe en souris mastocytaires-déficientes, et l’analyse du phénotype, des nombres et de la distribution des mastocytes engrafted à différents emplacements anatomiques. Ce protocole peut être utilisé pour évaluer les fonctions des mastocytes in vivo.

Abstract

Les mastocytes (MC) sont des cellules hématopoïétiques qui résident dans divers tissus et sont particulièrement abondantes aux sites exposés à l’environnement externe, tels que la peau, les voies respiratoires et le tractus gastro-intestinal. Mieux connus pour leur rôle néfaste dans les réactions allergiques IgE-dépendantes, les MCs ont également émergé en tant qu’acteurs importants dans la défense de l’hôte contre le venin et envahissant les bactéries et les parasites. Le phénotype et la fonction de MC peuvent être influencés par des facteurs microenvironnementaux qui peuvent différer selon l’emplacement anatomique et/ou basé sur le type ou le stade de développement des réponses immunitaires. Pour cette raison, nous et d’autres avons favorisé les approches in vivo sur les méthodes in vitro pour mieux comprendre les fonctions mc. Ici, nous décrivons des méthodes pour la génération de MCs cultivés moelle-dérivés de souris (BMCMCs), leur transfert adoptif dans les souris génétiquement MC-déficientes, et l’analyse du nombre et de la distribution de MCs adoptivement transférés à différents emplacements anatomiques. Cette méthode, appelée l’approche« mastocyte knock-in », a été largement utilisée au cours des 30 dernières années pour évaluer les fonctions des MCcs et des produits dérivés de MC in vivo. Nous discutons des avantages et des limites de cette méthode, à la lumière des approches alternatives qui ont été développées ces dernières années.

Introduction

Les mastocytes (MC) sont des cellules hématopoïétiques qui proviennent de progéniteurs pluripotents de moelle osseuse1-3. Après l’évacuation de la moelle osseuse, les progéniteurs des MC migrent dans divers tissus où ils se développent en MC matures sous l’influence des facteurs de croissance locaux1-3. Les MC résidants dans les tissus sont stratégiquement situés aux interfaces hôte-environnement, telles que la peau, les voies respiratoires et le tractus gastro-intestinal, où ils se comportent comme une première ligne de défense contre les insultes externes3-6. Les MC sont souvent sous-classés en fonction de leurs caractéristiques phénotypiques « de base » et de leurs emplacements anatomiques. Chez la souris, deux types de MC ont été décrits: les MC de type « tissu conjonctif » (CTMCs) et les MCs muqueux (MMCs)1-3,7,8. Les CTMCs sont souvent situés autour des veinules et près des fibres nerveuses, et résident dans les cavités sérales, tandis que les MMC occupent des emplacements intraépithéliaux dans l’intestin et la muqueuse respiratoire1-3.

De nombreuses méthodologies ont été appliquées pour étudier les fonctions biologiques des MC9-13. De nombreux groupes se sont concentrés sur des approches in vitro utilisant soit des lignées cellulaires (telles que les lignées MC humaines HMC114 ou LAD215,16),des MC dérivées in vitro (telles que les MC17dérivées du sang périphérique humain, ou des MC cultivés dérivés de la moelle osseuse de souris [BMCMC]18,des MC cultivés dérivés de la peau fœtale [FSCMC]19 et des MC dérivés de cellules péritonéales [PCMC]20) ou des MC isolés ex vivo provenant de différents sites anatomiques. Tous ces modèles sont largement utilisés pour étudier les détails moléculaires de la biologie de MC, tels que les voies de signalisation impliquées dans l’activation de MC. Cependant, un aspect important de la biologie des MC est que leurs caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles(par exemple,la teneur en protéase des granules cytoplasmiques ou la réponse à différents stimuli) peuvent être modulées par localisation anatomique et microenvironnement2,7. Étant donné que le mélange exact de tels facteurs rencontrés in vivo peut être difficile à reproduire in vitro,nous privilégions l’utilisation d’approches in vivo pour obtenir des informations sur les fonctions des MC9.

Il existe plusieurs souches de souris présentant une déficience génétique en MC, telles que les souris WBB6F1–Kit W/W-v ou C57BL/6-Kit W-sh/W-sh largement utilisées. Ces souris manquent d’expression et/ou d’activité de KIT (CD117), le récepteur du principal facteur de cellules souches de facteur de croissance MC (SCF)21,22. En conséquence, ces souris ont un déficit profond en MC mais ont également des anomalies phénotypiques supplémentaires liées à leurs mutations c-kit (chez les souris WBB6F1–Kit W/W-v) ou aux effets de la grande inversion chromosomique qui entraîne une réduction de l’expression duc- kit (chez les souris C57BL/6- Kit W-sh/W-sh) 9,10,12,23. Plus récemment, plusieurs souches de souris présentant un déficit constitutif indépendant de MC enc- kitont été signalées24-26. Toutes ces souris et quelques nouveaux types supplémentaires de souris inductibles mc-déficientes ont été récemment examinés en détail9,10,13.

Ici, nous décrivons des méthodes pour la génération de MCs cultivés moelle-dérivés de souris (BMCMCs), leur transfert adoptif dans les souris MC-déficientes, et l’analyse des nombres et de la distribution de MCs adoptivement transférés à différents emplacements anatomiques. Cette méthode dite de « mastocyte knock-in » peut être utilisée pour évaluer les fonctions des MC et des produits dérivés de MC in vivo. Nous discutons des avantages et des limites de cette méthode, à la lumière des approches alternatives qui ont été développées ces dernières années.

Protocol

Tous les soins et expérimentations sur les animaux ont été menés conformément aux directives des National Institutes of Health et avec l’approbation spécifique du Institutional Animal Care and Use Committee de l’Université Stanford. 1. Génération et caractérisation de mastocytes cultivés dérivés de la moelle osseuse (BMCMC). Remarque : Les BMCMC donneurs doivent être générés à partir de cellules de moelle osseuse du même fond génétique que les…

Representative Results

Un aperçu de l’approche del’enramationdes mastocytes est montré à la figure 1,et comprend la génération de BMCMC, le nombre de cellules qui devraient être greffées i.p., i.d. ou i.v. dans des souris déficientes en MC (le nombre peut être varié si indiqué en fonction de la conception expérimentale) et l’intervalle entre la greffe et l’expérience en fonction du site d’injection (cet intervalle peut également varier, si indiqué; par exemple,le contenu des médiateu…

Discussion

Près de 30 ans après sa description initiale38, l’approche «mastocyte knock-in» continue de fournir des informations précieuses sur ce que les MC peuvent faire ou ne peuvent pas faire in vivo. Les fonctions de MCs ont été longtemps pensées pour être limitées à leur rôle dans l’allergie. Les données générées à l’aide de l’approche «mastocyte knock-in» ont changé ce point de vue, en fournissant des preuves que les MC peuvent, entre autres fonctions, jouer de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

N.G. est récipiendaire de bourses de la Français Fondation pour la Recherche Médicale FRM et de la Fondation Philipp ; R.S. est soutenu par la Fondation Lucile Packard pour la santé des enfants et le numéro de prix CTSA nih/NCRR de Stanford UL1 RR025744; P.S. est soutenu par une bourse Max Kade de la Fondation Max Kade et de l’Académie autrichienne des sciences et une bourse Schroedinger du Fonds autrichien pour la science (FWF): J3399-B21; S.J.G. remercie le soutien des national institutes of health subventions U19 AI104209, NS 080062 et du programme de recherche sur les maladies liées au tabac de l’Université de Californie; L.L.R. reconnaît le soutien de la Fondation nationale de la recherche sur l’arthrite (ANRF) et de la subvention K99AI110645 des National Institutes of Health.

Materials

1% Antibiotic-Antimycotic Solution Corning cellgro 30-004-Cl
3 ml Syringe Falcon 309656
35 mm x 10 mm Dish Corning cellgro 430588
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube Falcon 352058
Acetic Acid Glacial Fisher Scientific A35-500
Alcian Blue 8GX Rowley Biochemical Danver 33864-99-2
Allegra 6R Centrifuge Beckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified eBioscience 14-0161-81
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M7522
BD 1 ml TB Syringe BD Syringe 309659
BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles BD Precision Glide Needle 205155
BD 25G 5/8 Needles BD Syringe 305122
BD 30G x1/2 Needles BD Precision Glide 305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube Falcon 352097
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cytoseal 60 Mounting Medium Richard-Allan Scientific 8310-4
Cytospin3 Shandon NA
DakoCytomation pen Dako S2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Corning cellgro 15-013-CM
Ethanol Sigma Aldrich E 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma Aldrich F4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control eBioscience 14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) eBioscience 11-1171-82
Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
Giemsa Stain Modified Sigma Aldrich GS-1L
Isothesia Henry Schein Animal Health 29405
May-Grunwald Stain Sigma Aldrich MG-1L
Multiwell 6 well plates Falcon 35 3046
Olympus BX60 Microscope Olympus NA
Paraplast Plus Tissue Embedding Medium Fisher Brand 23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control eBioscience 12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x Corning cellgro 21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) eBioscience 12-5898-82
Propidium Iodide Staining Solution eBioscience 00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3 Peprotech 213-13
Safranin-o Certified Sigma Aldrich S8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2 Beckton Dickinson 353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2 Beckton Dickinson 353110
Toluidine Blue 1 % Aqueous LabChem-Inc LC26165-2
Recombinant Mouse SCF Peprotech 250-03
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Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, P., Tsai, M., Galli, S. J., Reber, L. L. Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using ‘Mast Cell Knock-in‘ Mice. J. Vis. Exp. (99), e52753, doi:10.3791/52753 (2015).
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