אוכלוסיות תאי דם Assaying של<em> תסיסנית melanogaster</em> זחל
Summary
Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.
Abstract
בבעלי חוליות, hematopoiesis מוסדר על ידי מייקרו-סביבות אינדוקטיביים (נישות). כמו כן, בmelanogaster תסיסנית אורגניזם מודל חסר חוליות, מייקרו-סביבות אינדוקטיביים הידועים ככיסי Hematopoietic זחל (HPS) זוהו כאתרים אנטומיים לפיתוח וההסדרה של דם תאים (hemocytes), בפרט של שושלת מקרופאג העצמית חידוש. HPS הוא segmentally חזר כיסים בין האפידרמיס ושכבות שרירים של הזחל, המהווה גם כן תאי עצב תחושתיים של מערכת עצבים ההיקפית. בזחל, תושב hemocytes (הנייח) חשוף לאנטי-אפופטוטיים, דבק ורמזי שגשוג מתאי העצב התחושתי אלה ורכיבים שעלולים להיות אחרים של HPS, כגון השרירים הבטנה ושכבות אפיתל. במהלך התפתחות נורמלית, שחרור הדרגתי של hemocytes התושב מדלקי HPS האוכלוסייה של hemocytes במחזור, ששיאו בשחרורו של מורח 'של hemocytes התושב בתחילת מטמורפוזה. תקיפות חיסוניים, פגיעה פיזית או הפרעה מכאנית לעורר את שחרורו המוקדם של hemocytes התושב למחזור. המתג של hemocytes זחל בין מקומות תושב ומחזור הדם מעלה את הצורך בתקן / הליך נפוץ לבודד באופן סלקטיבי ולכמת שתי אוכלוסיות של תאי דם אלה מזחלים תסיסנית יחידים. בהתאם לכך, פרוטוקול זה מתאר שיטה אוטומטית לשחרר ולכמת את התושב וhemocytes במחזור מזחלים בודדים. השיטה מאפשרת גישות vivo לשעבר, ועשויה להיות מותאמת לשרת מגוון של שלבי התפתחות של דרוזופילה ואורגניזמים חסרי חוליות אחרות.
Introduction
מחקר במודל חסר חוליות דרוזופילה melanogaster יש מונע הגילוי של חסינות מולדת 1, ויש להקל את ההבנה של היבטים שונים של התפתחות תאי דם 2-4. Hematopoiesis תסיסנית ניתן לחלק את שושלת היוחסין של hemocytes זחל / העוברי שמקורם ב עובר ולהרחיב בזחל, והשושלת של בלוטת הלימפה hemocytes 4,5. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתמקד בשושלת של hemocytes העוברי / זחל, אשר בזחל תסיסנית כוללת בעיקר plasmatocytes (מקרופאגים) וכמה תאי גביש 4. כיסים בזחל, hemocytes של העובר להתמיד וליישב segmentally חזרו ומסוף Hematopoietic (HPS) ממוקמים בין האפידרמיס ושכבות שרירים של קיר גוף זחל 5,6. בהתבסס על אופיים כמקרופאגים עצמיים חידוש 6, המגורים העיקריים שלהם במייקרו-סביבות רקמות מקומיות 6, 7, והשושלת שלהם מתאי הדם המוקדמים מתעוררים במהלך הפיתוח 6,8, אוכלוסיית תאי הדם הזה נחשבת דומה למקרופאגים חוליות עצמי חידוש רקמות, שושלת מיאלואידית עצמאית זוהתה לאחרונה במגוון רחב של מינים 4,9,10. עם זאת, בדרוזופילה, חלק או את כל תאי התושב אלה מראים גם גמישות ללהצמיח סוגים אחרים של תאי דם כגון תאי גביש 11,12.
hemocytes הזחל הוא בעיקר תושב (נייחים), אבל נמצא במצב יציב דינמי בין HPS השונים. הם משתחררים בהדרגה למחזור, בפרט כזחל instar 3 rd גישות pupariation 5-7. אתגרים חיסוניים, פציעה או להוביל הפרעה מכאנית למוקדם, במקרה האחרון הפיכים, גיוס של hemocytes התושב אל hemolymph 4,6,13.
מחקרים קודמים הציעו כי תושב ומחזורhemocytes זחל הוא מאותו השושלת, אך נבדלים בתכונות הדבקה או ביותם 6,7,13,14. בידוד סלקטיבי של מחזור לעומת hemocytes התושב גילה רמות גבוהות של ריבוי באוכלוסיית hemocyte התושב, המצביע על החשיפה שלהם לרמזים אינדוקטיביים מHPS זחל HPS 6. תסיסנית מכוסים על ידי עור ושכבות שרירים ונמל נוסף אשכולות נוירון חושיים של מערכת העצבים ההיקפית (PNS) ותפקוד כבד דומה oenocytes 6. מבחינה תפקודית, ניסויי אבלציה התא שעברו מוטציה הגנטיים והוכיחו כי תאי עצב תחושתיים נוכחי בHPS לתמוך בהישרדות ולוקליזציה הטרופיות של hemocytes זחל 6.
כאן אנו מתארים שיטה לבידוד הספציפי והכימות של התושב וhemocytes במחזור מזחלים תסיסנית אחת, ופרוטוקול לגיוס hemocyte מכאני. השיטות יכולות לשמש לvivo לשעברמחקר של hemocytes ועוד יכול להיות מותאם לשלבי התפתחות אחרים תסיסנית כגון גולם ובוגר, ומערכות חסרי חוליות אחרות. מאז מחקרים קודמים לא הבחינו בין התושב וhemocytes במחזור, פרוטוקול זה מספק סטנדרטי לחקר תאי דם תושב נפוץ ויעזור להגדיל את העקביות של מחקר בתאי דם חסר חוליות.
ראשית, Hemocyte בליד / לגרד Assay מתאר את בידוד ההפרש וכימות אוטומטי של תושב מסומן חלבון פלואורסצנטי ומחזור אוכלוסיות hemocyte מזחלים תסיסנית יחידים; הפרוטוקול מספק שתי אפשרויות למיקרוסקופים לסרוק מצוידים רגילים ואריח (איור 1). כתוצאה מכך, השיעור של hemocytes במחזור ואת המספר הכולל של hemocytes לזחל מתקבלים. השיטה מסתמכת על זחלים תסיסנית מהונדסים המבטאים חלבון פלואורסצנטי בין תאי הדם שלהםאוּכְלוֹסִיָה. הבחירה של נהג hemocyte או כתב קובעת את התוצאה, כלומר, שאוכלוסייה של תאי דם דמיין ולכמת. לתייג בעיקר מקרופאגים (plasmatocytes), המהווה את הרוב המכריע של התושב ואוכלוסיית hemocyte במחזור של זחל תסיסנית 6, transgenes המתאים כוללים Hml 6 Δ-DsRed, HmlΔ -GAL4 15, Pxn -GAL4 16, Crq-GAL4 (על ידי ח Agaisse 16), או אוכל-GAL4 17; לתיוג האוכלוסייה הקטנה יחסית של תאי גביש, קווים מתאימים הם BcF6-CFP ו-GFP 18, או LZ-GAL4 (על ידי ג 'פולוק 19); לlamellocytes תיוג, סוג תא מיוחד בעיקר נגרם על ידי אתגרים ופציעה 13 חיסוניים, למשל, MSNF9mo-mCherry ניתן להשתמש 17. כמה נהגים מהונדסים באים לידי ביטוי במגוון של דם מובחןתאים ואבות, כגון הוא – GAL4 20, אשר תוויות כ -80% מכלל תאי דם זחל 20. אנא שים לב כי בכל המקרים שבי GAL4 נהגים משמשים, שילוב עם כטב"מ-GFP או אחר כטב"מ-transgene חלבון פלואורסצנטי נדרש. בסעיף התוצאות, שיטה זו משמשת כדי לפקח מספר תאי דם וזרימת התנהגות במהלך התפתחות זחל.
שנית, Hemocyte ההפרעה Assay מתאר שלב מקדים שנועד לנתק hemocytes התושב על ידי מניפולציה חיצונית, אשר לאחר מכן מאפשרת ההערכה של היכולת של hemocytes מחדש לדבוק ובית לHPS בתוך מסגרת זמן מוגבלת (30 – 60 דקות) 6. בדרך כלל assay זה ואחריו בליד / לגרד Assay כדי לקבוע את אחוז מחזור hemocytes לזחל. אנו מציגים פרוטוקול פשוט עבור assay זה (איור 1D), המשתמש בהפרעה על ידי שנינות vortexingחרוזי זכוכית h, ולא מניפולציה של זחל יחיד עם מברשת צבע כפי שתואר לעיל 6. בסעיף התוצאות, assay זה משמש על מנת להוכיח כי לצוף hemocytes זמני מנותק בhemolymph וניתן לשחזר בכל החלק של מחזור hemocytes. Assay שימושי גם לכמת הבדלים של hemocytes בביות / ההדבקה שלהם לאתרי תושב, השוואה לדוגמא, רקע גנטי שונים או תנאי גירוי. אנא שים לב כי מניפולציה מכאנית זו משקפת תהליך הפיך ושונה מגיוס hemocyte התושב מדלקת או מושרה פציעה, שהם בדרך כלל לא הפיכים במסגרת זמן קצרה 4,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מתארים את השיטה הראשונה להתאושש כמותית תאי דם תושב ומחזור מהזחלים תסיסנית אחת, ולכמת שתי אוכלוסיות hemocyte אלה. הפרוטוקול כולל את השחרור רציף של תאי דם במחזור והתושב, ואחריו הדמיה וספירה תאים אוטומטית. hemocytes תושב הזחל יכול להיות מגויס זמני למחזור על ידי הפרעה מכאנית, תהליך שידוע להיות הפוכים במידה רבה בתוך 30 – תקופת החלמה דקות 60 6. בהתאם לכך, פרוטוקול זה נבדק בשתי דרכים, (1) על ידי בחינה של מספר hemocyte כולל לזחל וחלק של מחזור hemocytes במהלך התפתחות זחל, ו- (2) על ידי ניסוי פירוק hemocytes התושב באמצעות שיטה אוטומטית, אשר אישר את מתאם הדוק של לוקליזציה hemocyte ומספר hemocyte בתושב ואוכלוסיות במחזור. בנוסף, שחזור של השיטה הודגם על ידי שיתוףmparing שני מערכי נתונים של משכפל ביולוגי.
בעבר, מעבדות השתמשו במגוון של טכניקות לכמת hemocytes זחל 6,13,21. פרוטוקול זה קובע סטנדרט לאחזור ולכמת אוכלוסיות תאי דם תושב ומחזור מזחלי דרוזופילה, מתן פלטפורמה להתאמה בקלות משותף. השיטה המתוארת היא קריטית עבור מחקרים המתמקדים בתפקיד של hemocytes התושב ומייקרו-הסביבה שלהם, Hematopoietic Pockets 4-6, והוא מתאים ללמוד זני חלבון פלואורסצנטי נשיאת transgene דרוזופילה בסוג בר ורקעים מהונדסים גנטי. הפרוטוקול רלוונטי גם למחקרים המתמקדים בגיוס hemocyte אחרי אתגר חיסוני או פציעה, ואיתות גנטית או סביבתי הנגרמת על שמפעיל גיוס של hemocytes או שינויים במספר כולל hemocyte (בדיקה ב 4) התושב. יש לציין כי, במקרים של די המוקדמתfferentiation ושחרורו של hemocytes מבלוטת הלימפה, הבחנה / זחל עוברי לעומת שושלות בלוטת הלימפה עשויים להיות מוגבל על ידי דפוס הביטוי של כתב hemocyte הניאון משמש.
הפרוטוקול המובא כאן מסתמך על חיים הדמיה, hemocytes fluorescently שכותרתו. בעתיד, זה ניתן לשינוי על מנת לאפשר זיהוי של תאים שוחררו לאחר קיבוע, למשל, באמצעות immunocytochemistry. במקרה זה, הפרוטוקול ייתכן שיהיה הצורך מותאם כדי להבטיח הדבקה מלאה של תאי הדם, לדוגמא על ידי הגדלת פעמים דגירה הידבקות, והוספת שקופיות ציפוי דבק, כגון א concanavalin מאז השיטה מאפשרת אחזור של hemocytes ולשעבר המניפולציה שלהם vivo, זה יועיל למגוון רחב של מחקרים ביולוגיים וביוכימיים התפתחותית, תא. תאי תושב ודם במחזור נמצאים בכל שלבי postembryonic ההתפתחותי של דרוזופילה וחסרת חוליות אחרות 22, suggesting הסתגלות של שיטה זו תיהנה מגוון רחב של מחקרים מעבר למערכת hematopoietic זחל תסיסנית.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Jesper Kronhamn ודן Hultmark, מיכאל Galko, והמרכז במלאי Bloomington עבור מניות הזבוב. תודה מיוחדת לקורטני Onodera לייעוץ עם ניתוח סטטיסטי. אנו מודים קתרינה זהב לקריאה ביקורתית של כתב היד, וקלף Makhijani, קתרינה זהב, חברי המעבדה Derynck, ואנשי המעבדה Nystul לדיון והערות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתכנית קליפורניה בסן פרנסיסקו ליו-הרפואי פריצת הדרך במחקר (PBBR), רוד מרכז, הלמן קרן, האגודה האמריקנית לסרטן RSG DDC-122,595, איגוד לב האמריקאי 13BGIA13730001, הקרן הלאומית למדע 1,326,268, המכונים הלאומי לבריאות 1R01GM112083-01 ו 1R56HL118726-01A1 (לKB).
Materials
| 6cm/9cm Petri dishes | One for each genotype to be evaluated | ||
| Water squirt bottle | |||
| Metal spoon/spatula | |||
| Thin paintbrush | e.g. a "liner" | ||
| Glass cavity dish | |||
| PAP pen: Super PAP PEN IM3580 | Beckman Coulter | ||
| Glass slides | Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g. 2mm squares. | ||
| Moist chamber | This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom | ||
| Schneider’s Drosophila cell culture media | Invitrogen | ||
| Cold block | This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color | ||
| Two 1ml syringes with needles (27G ½) | Becton Dickinson | For dissections. | |
| Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2mm) | Fine Science Tools | ||
| Glass beads, 212-600 micron | Sigma | ||
| 2 ml Eppendorf tubes | Eppendorf | One per genotype evaluating | |
| Vortex Mixer | Fisher Scientific | ||
| Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. Suitable transgenes include: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes. | |||
| Fluorescence dissecting microscope | Leica | Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module | |
| Inverted fluorescence microscope with camera attachment | Leica or Keyence | With or without tile scanning function (eg. Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series) |
References
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5, 673-690 (2003).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).
- Gold, K. S., Brückner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Experimental hematology. 42, 717-727 (2014).
- Makhijani, K., Brückner, K. Of blood cells and the nervous system: Hematopoiesis in the Drosophila larva. Fly. 6, 254-260 (2012).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Brückner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138, 5379-5391 (2011).
- Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. Postembryonic hematopoiesis in Drosophila. Dev Biol. 230, 243-257 (2001).
- Holz, A., Bossinger, B., Strasser, T., Janning, W., Klapper, R. The two origins of hemocytes in Drosophila. Development. 130, 4955-4962 (2003).
- Sieweke, M. H., Allen, J. E. Beyond stem cells: self-renewal of differentiated macrophages. Science. 342, 1242974 (2013).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nature immunology. 14, 986-995 (2013).
- Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biology Open. 1-9, (2015).
- Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. eLife. , (2015).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4805-4809 (2009).
- Babcock, D. T., et al. Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 10017-10022 (2008).
- Sinenko, S. A., Mathey-Prevot, B. Increased expression of Drosophila tetraspanin, Tsp68C, suppresses the abnormal proliferation of ytr-deficient and Ras/Raf-activated hemocytes. Oncogene. 23, 9120-9128 (2004).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila Genesis. 47, 771-774 (2009).
- Gajewski, K. M., et al. Identification of a crystal cell-specific enhancer of the black cells prophenoloxidase gene in Drosophila. Genesis. 45, 200-207 (2007).
- Lebestky, T., Chang, T., Hartenstein, V., Banerjee, U. Specification of Drosophila hematopoietic lineage by conserved transcription factors. Science. 288, 146-149 (2000).
- Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 14192-14197 (2004).
- Shim, J., Mukherjee, T., Banerjee, U. Direct sensing of systemic and nutritional signals by haematopoietic progenitors in Drosophila. Nature cell biology. 14, 394-400 (2012).
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
