Выделение и криоконсервация новорожденной крысы кардиомиоцитов
Summary
The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.
Abstract
Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for α-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.
Introduction
Культура клеток кардиомиоцитов является важным инструментом в современной сердечной исследований. Новорожденных кардиомиоцитов крыс (NRCMs) обычно используются с изоляцией и культура легче, чем у взрослых кардиомиоцитов крыс 1. Метод NRCM еще имеет ряд ограничений, включая длительную процедуру выделения и распространения ограниченной клеток в блюдо. Есть многочисленные протоколы для изоляции NRCMs с наиболее широко требуя 4-48 ч работы 2-6. Кроме того, клетки часто изолированы от 1 до 2-дневных крысят 2,4-7; Сроки рождения могут быть непредсказуемыми и конфликт с другой работой в лаборатории. Выделений может быть неэффективным и расточительным, если только небольшое количество клеток, необходимых для экспериментов. Большинство усилий по улучшению внимания рабочего процесса на сокращение времени изоляции, но это не решает проблемы синхронизации рождение щенков.
В качестве альтернативы, многие лаборатории используюткардиомиоциты, полученные из эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). Тем не менее, процесс перепрограммирования и / или дифференцировки может быть очень много времени и дорого, а также. Там могут быть и другие проблемы при использовании этих клеток, как в пробирке моделей миоцитов. Оба Esc- и iPSC- полученные кардиомиоциты как было показано, демонстрируют разницу в электрофизиологических из первичных кардиомиоцитов 8-10.
Диссоциированные NRCMs способны храниться в течение нескольких дней с помощью охлаждения 11, но это позволит на длительное хранение. Жидкий азот, как правило, используется для сохранения клеток в течение более длительного периода времени, но требует криопротектора, такие как диметилсульфоксид (ДМСО). Предыдущие исследования показали, что идеальным концентрация 5-10% ДМСО в морозильной СМИ позволяет криоконсервации NRCMs, но даже тогда жизнеспособность остается низким 12. Хотя ДМСО помогает защитить клетки во время бесплатноZing, он может быть токсичным к клеткам при концентрации выше 1,5% 13. Предыдущие исследования показали, что медленно снимая ДМСО из клеток, может улучшить Жизнеспособность 14.
Мы стремились повысить эффективность NRCM на основе клеток анализов по криоконсервировать клеток следующую изоляции. Это позволяет клеткам быть размораживали и использовали в случае необходимости, уменьшая частоту выделений и потребления животным. Используя этот метод, мы покажем, что можно криоконсервируют NRCMs и оттепель их для использования в более позднее время. После оттаивания клетки поддерживать приемлемый жизнеспособность и производить NRCM культур, которые являются положительными для α-саркомерный актинин (α-SA) и договора спонтанно.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол позволяет NRCMs должны быть изолированы, криоконсервированы, и оттаивали. Размораживание клеток является важным часть процедуры. Серия ДМСО разведений используется для удаления ДМСО медленно из клеток 14. Важно, что извлечение ДМСО быть выполнена быстро, как клетки ос…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by funding from American Heart Association 12BGIA12040477, NC State University Chancellor’s Faculty Excellence Program, and National Natural Science Foundation of China H020381370216.
Materials
| IMDM (+25mM HEPES +L-glutamine) | Gibco | 12440-046 | With added 25mM HEPES and L-glutamine |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| HBSS (+Ca +Mg) | Corning | 21-020-CV | With added calcium and magnesium, pH 7.1-7.4 |
| Trypsin 0.25% | Gibco | 25300-056 | |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | Freezing media |
| Cryogenic Vial | Corning | 430659 | |
| Collagenase | Sigma | C1889-50MG | |
| 40μm Cell Strainer | Greiner Bio-One | 542040 | |
| Sterilizing Vacuum Filter (0.22μm) | Corning | 431118 | |
| 50mL Conical | Corning | 430828 | |
| 15mL Conical | Corning | 430790 | |
| trypan blue | Cellgro | 25-900-CI | |
| Mr Frosty Freezing Container | ThermoScientific | 5100-0001 | |
| Millicell EZ SLIDES | Millipore | PEZGS0416 | |
| α-sarcomeric actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Bromodeoxyuridine | BD Biosciences | 51-7581KZ |
References
- Louch, W. E., Sheehan, K. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Miragoli, M., Salvarani, N., Rohr, S. Myofibroblasts Induce Ectopic Activity in Cardiac Tissue. Circulation Research. 101, 755-758 (2007).
- Simpson, P., Savion, S. Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol. Circulation Research. 50 (1), 101-116 (1982).
- Simpson, P., McGrath, a., Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Rohr, S., Flückiger-Labrada, R., Kucera, J. P. Photolithographically defined deposition of attachment factors as a versatile method for patterning the growth of different cell types in culture. Pflügers Archive : European Journal of Physiology. 446 (1), 125-132 (2003).
- Zhang, B., Green, J. V., Murthy, S. K., Radisic, M. Label-free enrichment of functional cardiomyocytes using microfluidic deterministic lateral flow displacement. PloS One. 7 (5), e37619 (2012).
- Boateng, S. Y., Hartman, T. J., Ahluwalia, N., Vidula, H., Desai, T. Inhibition of fibroblast proliferation in cardiac myocyte cultures by surface microtopography. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 285 (1), C171-C182 (2003).
- Fu, J. -. D., Li, J., et al. Crucial role of the sarcoplasmic reticulum in the developmental regulation of Ca2+ transients and contraction in cardiomyocytes derived from embryonic stem cells. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (1), 181-183 (2006).
- Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. a Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation. Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).
- Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
- Uchida, T., Nagayama, M., Taira, T., Shimizu, K., Sakai, M., Gohara, K. Optimal temperature range for low-temperature preservation of dissociated neonatal rat cardiomyocytes. Cryobiology. 63 (3), 279-284 (2011).
- Miyamura, K., Nagayama, M., et al. Evaluation of viability of cryopreserved rat cardiac myocytes and effects of dimethyl sulfoxide concentration on cryopreservation. Cryobiology. 59 (3), 375 (2010).
- Rana, P., Anson, B., Engle, S., Will, Y. Characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: bioenergetics and utilization in safety screening. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 130 (1), 117-131 (2012).
- Yokomuro, H., Mickle, D. a. G., Weisel, R. D., Li, R. -. K. Optimal conditions for heart cell cryopreservation for transplantation. Molecular and Cellular Biochemistry. 242 (1-2), 109-114 (2003).
- Simpson, P., McGrath, a., Savion, S. Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines. Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).
- Evans, H. J., Western Goodwin, R. L. array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development. Molecular and Cellular Biochemistry. 303 (1-2), 189-199 (2007).
- Golden, H. B., Gollapudi, D., et al. Methods in Molecular Biology. , 205-214 (2012).
- Zlochiver, S., Muñoz, V., Vikstrom, K. L., Taffet, S. M., Berenfeld, O., Jalife, J. Electrotonic myofibroblast-to-myocyte coupling increases propensity to reentrant arrhythmias in two-dimensional cardiac monolayers. Biophysical Journal. 95 (9), 4469-4480 (2008).
- Chang, M. G., Zhang, Y., et al. Spiral waves and reentry dynamics in an in vitro model of the healed infarct border zone. Circulation Research. 105 (11), 1062-1071 (2009).
