Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Biomolecules Using EBL Fabricated Nanostructured Substrates

Robert F. Peters; Luis Gutierrez-Rivera; Steven K. Dew; Maria Stepanova

doi:10.3791/52712

JoVE Journal > Engineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

工程学

Yüzey EBL Fabrikasyon Nanostructured Alt Tabakalar Kullanma biyomoleküllerin Raman Spektroskopisi Algılama Geliştirilmiş

Published: March 20, 2015

doi:

10.3791/52712

Robert F. Peters^1,2, Luis Gutierrez-Rivera^1,2, Steven K. Dew^1,2, Maria Stepanova^1,2

¹Department of Electrical and Computer Engineering,University of Alberta, ²National Institute for Nanotechnology,National Research Council of Canada

Summary

We describe the fabrication and characterization of nano-biological systems interfacing nanostructured substrates with immobilized proteins and aptamers. The relevant experimental steps involving lithographic fabrication of nanostructured substrates, bio-functionalization, and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) characterization, are reported. SERS detection of surface-immobilized proteins, and probing of protein-ligand and aptamer-ligand binding is demonstrated.

Abstract

Fabrikasyon ve İmmobilize biyomoleküllerle katı destekler üzerinde metalik oluşturulan nano arabirim eşlenik nano-biyolojik sistemlerin karakterizasyonu rapor edilmiştir. İlgili deneysel adımlar tüm dizisi elektron ışın litografi, yüzeylerde biyomoleküllerin immobilizasyon kullanarak nanoyapılı yüzeylerde imalat içeren, açıklanan ve onların karakterizasyonu kullanarak yüzey Raman spektroskopisi (SERS). Nano-biyolojik sistemler üç farklı tasarımlar protein A, glikoz bağlayıcı protein ve dopamin DNA bağlama aptamer içeren kullanılır. Son iki durumda, ilgili ligandlar, D-glükoz ve dopamin bağlanma da buna dahildir. biyomoleküllerin üç çeşit farklı yöntem ile nano yapılı alt tabakalar üzerinde immobilize edilir ve SERS görüntüleme sonuçları rapor edilmiştir. SERS yetenekleri yüzey hareketsiz proteinlerden titreşim modlarını tespit etmek için, aynı zamanda, protein-ligand bir yakalamad aptamer-ligandı gösterilmiştir bağlanma. Sonuçlar, yüzey nano geometri, biyomoleküllerin immobilizasyon stratejisi, moleküller ve elde edilen SERS spektrumları ligand varlığında veya yokluğunda Raman aktivitesinin etkisini göstermektedir.

Introduction

Katı nanoyapıları ve biyolojik polimerler arabirim eşlenik nano-biyolojik sistemler geliştirmek ve karakterize etmek Yetenekleri nesil biyo-algılama ve biyo-kumanda teknolojileri ^1,2 daha fazla gelişmeler giderek daha önemli hale gelmektedir. Bu tür ilgili katı hal bileşenleri (mikro-nano veya elektrotlar, nano-mühendislik kaplama, nanotellerin, ya da nanopartiküllerin) ^2,3,4 imalatı araştırma alanları, bir dizi boyunca çok disiplinli çalışmalar içerir; istenilen Bioconjugatlar ^5,6,7 oluşturmak için yüzeylerde biyomoleküllerin immobilizasyonu; ve nano-biyolojik arayüzleri ¹ izleme. Çoğu durumda, en iyi imalat, biyo-işlevsellik ve karakterizasyon yöntemlerinin seçilmesi güçlü arası ilgilidir. Açıkçası, nanofabrikasyon teknikleri seçimi, sistemin katı hal bileşenlerinin gereksinimleri tarafından tahrik olacağını algılama yöntemi, büyük ölçüde bağımlı olan turn katılan Biyopolimerlerin doğası ve arayüz izleme amacına göre belirlenir.

Bioconjugate sistemleri ^1,3, yüzey Raman spektroskopisi (SERS) karakterize uygulanan teknikler geniş bir çeşitlilik Out yüzeyleri ^8,9,10,11 üzerinde kimyasal ve biyolojik türlerin tespiti için son derece umut verici bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. SERS moleküler titreşimler karşılık gelen benzersiz imza yakalama sağlayan yüzey hareketsiz biyomoleküllerin (Şekil 1) monokromatik ışık inelastik saçılma kullanır. Bu özellik, etiketler, kompleks kimyası ya da zaman alan adımları içermeyen farklı moleküller arasında ayırt etmek için, SERS biyo-algılama potansiyel olarak çok etkili bir yöntem sağlar. Sers bir diğer önemli avantajı yüksek hassasiyettir. asil metal Nano (SERS yüzeyler) ile etkileşim ışıkla lokalize yüzey plazmonları uyarma dramatik int artırırRaman mono tabakaları, tek moleküllü sınırı ^8,9,10,11 aşağı moleküllerin çok küçük miktarlarda tespitine olanak sağlayan, bir analit ile saçılma densite. Son olarak, çoğu biyomoleküllerin kararlı olmak sulu çözümler gerektirir. Su genellikle sınırlı Raman aktiviteye sahip olduğundan, sulu örneklerinden arka plan sinyali ⁹ minimize edilir. Sers Uygulamaları son on ¹⁰ üstel artış sergiledi. Ancak, Sers çok tartışılan meydan Raman saçılması elektromanyetik dalgalar geliştirme plasmonik ^11,12,13 kaynaklı metal nano boyut, şekil ve aralık eleştirel bağlı olmasıdır. Alt-tabaka geometrisi nano boyutta gereklidir fazla verimli ve tekrarlanabilir SERS ölçümler elde etmek için kontrol eder.

Şekil 1. ScYüzey Raman spektroskopi heme.

SERS substratlar ^11,12,13 imal kullanılan birçok yöntem kabaca aşağıdan yukarıya ve yukarıdan aşağıya yöntemleri ayrılabilir. Birinci tip yöntemleri kendini montaj veya oluşturulan nano üretilmesi için yönlendirilmiş kimyasal sentez çeşitli işlemleri kullanır. Genellikle örnekler katı destekler ^11,12,13, termal, tükürükle, ya da pürüzlü metal filmlerden ^11,12 elektrokimyasal birikimi ve çeşitli kimyasal sentez yöntemleri ¹³ tek dağılımlı nanopartiküllerin immobilizasyonunu içerir ele. Bu tür teknikler nispeten basit ve ucuz olma eğilimi olsa da, çoğu bir yapıların konumu üzerinde kontrol eksikliği ve sınırlı numune-örnek tekrarlanabilirlik tarafından zorlanmaktadır.

Buna karşılık, yukarıdan aşağıya litografi teknikleri yüzeylerde istenilen desenleri oluşturmak için böyle parçacık demetleri gibi manipulable araçlar kullanır. En sık kullanılan birkatı destekler ^11,12 farklı substrat tasarımları için izin de 10 nm ve altındaki bir esneklik aşağı özellikleri üzerinde Nanolitografi yöntemleri, elektron ışın litografi (EBL), mükemmel kontrol sağlar. EBL ise, elektron demeti maruz kalan bölgelerde kimyasal değişikliğe neden olan elektron duyarlı malzeme (karşı) bir yüzeyi boyunca çaplı taramalar birkaç nanometre bir nokta aşağı odaklanmış. Pozitif tonu için bu direnç, uygun bir çözücü (geliştirici) artan bir çözünürlüğe yol polimetilmetakrilat (PMMA), karşı oluşturan polimer zincirlerinin kesilmesini elektron ışınına maruz kalma sonuçları gibi. Elektron ışınlı litografi bir işlem, bir alt-tabaka üzerinde karşı muntazam bir tabakanın yan kaplama içerir; bir elektron ışını ile bir vakum odası içinde hedeflenen karşı maddenin kalma; ve numune gelişimi çözünür bölgeleri kaldırmak için.

Böyle erimiş silis gibi metalik nanoyapılarda altında Dielektrik destekler, b vargösterilen een önemli ölçüde nedeniyle böyle bir silikon ^14,15 gibi diğer malzemelere kıyasla plasmonik dalgaların yerelleştirme sers yoğunluklarda artırmak için. Ancak EBL desenlendirme dielektrik yüzeylerde, özellikle nano, pozlama sırasında birikmesi şarj nedeniyle önemli zorluklar içermektedir. Daha önce, bu zorluklar karşı üzerinde iletken polimer tabakaları yerleştirerek aşılabileceği ^16,17 göstermiştir. Şekil 2 kaynaşık metalik oluşturulan nano üretmek için metal kaplama ve liftoff ardından EBL maruz kalma ve gelişme ile genel imalat işleminin bir şematik silika destekler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

E 2. Düzeni Şekil. demeti litografi, metal birikimi ve havalanış süreci dielektrik yüzeylerde ^16-19 metalik nanoyapıları imal için kullanılan adımlar lectron Bu yazıda EBL'nin, yüzeylerde biyo-fonksiyonalizasyon tarafından SERS yüzeyler imalat içeren işlem adımlarının tüm dizisini sunmak ve Raman toplanması. Bizim son eserlerinde ^18,19 keşfedilmeyi üç tasarımlar (bkz Şekil 3 ve 4, ve Tablo 1) ele alınmaktadır. Tasarım 1 'de, bir araya getiren protein A, bir kaynaşık silika (FS), destek ¹⁸ biyo-işlevselleştirilmiş Au nanoyapılarda üzerinde immobilize edilir, ve protein SERS algılama gösterilmiştir. Tasarım 2'de, yeniden birleştirici glukoz-ligand (D-glükoz) olan ve olmayan protein ^21,26,27 Ni kaplamalı FS Ag nanoyapılarda arasındaki boşlukları histidin etiketleri vasıtasıyla, immobilize edilmekte, ve protein glukozun bağlanması tespit edilir. Tasarım 3'te, tiollenmiş dopamin bağlanma DNBir aptamer ^19,23 FS Au nanoyapılarda üzerinde immobilize edilir, ve hareketsizleştirilmiş aptamer ile dopamin bağlanma gösterilmiştir. Yüzey Raman edinimi hazırlık ve farklı biyomoleküllerin ve immobilizasyon stratejileri temsilcisinin ilgili tüm deneysel adımlar Dahil, bu örnekler sers gelişmesine sers nano-biyolojik arayüzleri sorgulama keşif araştırma, geniş bir uygulama yelpazesi için yararlıdır Bir tanıma yöntemi olarak bağlayıcı protein ya da aptamer-ligand istihdam küçük moleküllerin biyosensörler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Immobiliza yöntemleri farklı biyomoleküllerin kullanarak üç tipik tasarımları 3. Düzenleri Şekilgetirir ve alt-tabaka malzemeleri: (A) kendi kendine bir araya tek tabaka deiyonize suda 11 mercaptodecanoic asit (SAM) (MUA) ile fonksiyonelleştirilmiş asil metal nano noktalar üzerinde immobilize edilmiş Protein A; (B), soy metal nano noktalar arasındaki alt-tabaka yüzeyi üzerinde hareketsiz D-glükoz ile kompleks Histidin ile-etiketlenmiş glukoz bağlama proteini (TRY); (C) asil metal nano-nokta üzerinde hareketsiz dopamin (DBA) ile tamamlandı dopamin bağlanma aptameri tiyol sonlandırılmış. Tablo 1 de ayrıntılara bakın. Panel (B) ile gösterilen Tasarım 2, karşılık gelen bağ olmadan bir örneği de karşılaştırma için hazırlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4.Üç tasarımlarda kullanılan Biyomoleküller: (A), protein A; (B), glikoz bağlayıcı protein ve D-glükoz; (C) DNA aptamer ve dopamin bağlanma dopamin. protein üçüncül yapılarının (a) ve (b) sırasıyla, ve LINUXAMD64 için VMD çizilmiş Protein Data Bank, PDB İD 1BDD ²⁰ 2HPH ^21, sürüm 1.9.1 ²² alınır. (c) aptamer ikincil yapı ValFold ²⁴ yazılımını kullanarak dizisi ²³ tahmin ve PseudoViewer 3.0 ²⁵ çizilir. G, A, T, C ve guanin, adenin, timin, sitozin ve nükleotidler karşılık mektuplar, sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

	Tasarım 1 </td>	Tasarım 2	Tasarım 3
Biopolymer	Protein A,	Glikoz bağlayıcı protein (GBP)	Dopamin bağlama aptamer (DBA)
Cilt	11-Mercaptoundecanoic asit (MUA) kendinden montajlı tek tabaka (SAM)	Histidin etiketleri	Tiyol bağlayıcılar
Ligand	Hiçbiri	D-glikoz	Dopamin
Çözüm	Iyonu giderilmiş (Di) su	Potasyum fosfat tamponu	Tris (hidroksimetil) aminometan (TRIS), etilendiamintetraasetik asit (EDTA) tampon maddesi; Fosfat tamponlu tuz (PBS)
Yüzey	FS Au yapılar	Ni kaplamalı FS Ag yapılar	FS Au yapılar
Desenli area	X 10 mm 4 um	X 8 mm 4 mm	X 10 mm 4 um
Model	Au noktalar, 50 nm zift	Ag noktalar, 40 nm zift	Au altıgenler, 200 nm sahası
		Ag altıgenler, 200 nm sahası	Au yapılandırılmamış pedler
		Ag yapılandırılmamış pedler
EBL maruziyet dozu	Nokta:	Nokta: 105 uC / cm ²	Altıgenler: 180 uC / ^cm2
	Dizi Ben 120 uC / cm ²	Altıgenler: 170 uC / ^cm2
	Dizi II 96 uC / cm ²
	Dizi III 72uC / cm ²
Lazer emisyon dalga boyu	532 nm	532 nm	780 nm

Tablo 1. nano-biyolojik sistemlerin üç tasarımlar.

Protocol

1. Yüzey Hazırlığı 1 cm içine × 1 cm veya daha küçük zar erimiş silika (FS) gofreti kesmek için bir yarı iletken dicing testereyi kullanın. Bir pirana çözelti içinde temiz örnekleri (lH 2SO 4: H2O 2, 3: 1 'dir; DİKKAT: güçlü bir oksitleyicidir) 15 dakika için banyo 28, daha sonra iyonu giderilmiş su içinde zar yıkayın ve azot kurutulur. Bir ocak numuneler 15 dakika için 180 ° C'de yukarı bakacak şekilde yerleştirin. RT ocak gözünün çıkardıktan sonra örnekleri soğutun. Tasarımlar, 1 ve 3 için, 2. adıma geçin. Tasarım 2 için, Ni 10 nm tabakası ile bir elektron ışını buharlaştırma odasına ve kat örnek yerleştirin. Elektron Işın litografi kullanarak Nano-desenli PMMA Maskeleri 2. Fabrikasyon (EBL) Spin-ceket PMMA karşı ve yüzeylerde iletken katmanlar. Ayrı ayrı aynanın üzerinde merkezi bir vakum aynası ve yer örnekleri ile bir gofret eğiren kullanın. YerPolimetilmetakrilat (PMMA) 1 damla 2 sn rampa süresi ile 60 saniye boyunca 3.500 rpm'de bir cam pipet ve spin kullanarak numunelerin merkezine karşı. 3-5 dakika boyunca, 180 ° C'de pişirin substratlar. Substratlar pişirme sonra, oda sıcaklığına örnekleri serin. Alt-tabakalar soğutuldu ve bükme mandreni geri ile, alt-tabaka üzerindeki iletken polimerin bir damla yayıldı. 2 sn rampa süresi ile 3.000 rpm'de 40 sn için substrat Spin. 1 dakika boyunca 80 ° C 'de fırında örnekler. Standart prosedür 16,17,18,29 göre EBL pozlamayı gerçekleştirin. Üreticinin talimatlarını kullanarak, mümkün olan en küçük kiriş adım büyüklüğü ile Tablo 1 özellik dozlarını kullanan bir pozlama tasarımı hazırlamak. Elektron ışın litografi odasına örnek yükleyin. EBL sistem otomatik netleme yoksa, odak için boncuk kenarından uzak desen maruz yerden uzakta küçük bir çizik kullanıning. Üreticinin talimatlarını kullanarak, odaklama gerekli ve uygun astigmatizma düzeltme yanı sıra yazma alanı hizalama ve açığa örnek gerçekleştirin. Uygun pozlama profili ve en iyi desen kalitesi için izin vermek için, 30 keV elektron demeti enerjisi ve pozlama için 7.5 mikron diyafram kullanın. Iletken polimer çıkarın ve maruz örnekleri geliştirmek. Geliştirici karışımı ile iletken polimer ve bir ikinci beher çıkarmak için iyonu giderilmiş (Di) su ile bir çanak hazırlanması (IPA: H2, O, 7: 3), ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca karıştırın. Bir çalkalama maddesi olarak üçüncü bir beher içinde izopropanol (yüksek saflıkta) hazırlayın. Cımbız kullanarak, daha sonra, iletken polimer filmi kaldırmak geliştirici içine numuneyi yerleştirmek ve yavaş yavaş yukarı ve aşağı 20 saniye cımbız taşımak için 3 sn suya örnekleri yer. Hemen izopropanol substratlar aktarmak ve 10 saniye daha durulayın, daha sonra azot ile örnek kurulayın. </ Ol> 3. Soy metal Nanoyapıları İmalatı Numunelerin ön yüzünde biriktirilecek buharlaştınldı metal izin vermek için ters elektron ışını buharlaştırıcı sistemi içine örnekleri yerleştirin. Yaklaşık olarak 0.1 nm / saniye bir hızda Tasarımlar 1 ve 3 ve Tasarım 2 için 10 nm kalınlığında bir Ag tabakası için numune üzerine 10 nm kalınlığında bir Au tabakası bırakın. Su ile tavsiye edilen yüksekliğe bir sonikasyon sistemini doldurun ve aseton ile ayrı beher doldurun. Beher alt örnek bir yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirilir ve numune 10 dakika boyunca bekletin. Beher Holding, su banyosu içine yerleştirin ve aseton yüksekliği suyun yüksekliğini maç ve sonikasyon sistemi açmak için izin verir. Sonication kadar 60 saniye meydana gelmesine izin. Adım 3.1'de ayrıntılı olarak aynı prosedür kullanılarak, FS (Tasarımlar 1 ve 3) ve Ni kaplamalı FS (Tasarım 2) substr 10 nm kalınlığında bir metal filmlerle birikimi ile muntazam Au, Ag yüzey alt-tabakalarının hazırlanmasıadım 2 atlama ates. Substratların 4. Biyo-işlevselleştirme Tasarım 1 örnekleri hazırlayın: Oda sıcaklığında, etanol içinde 11 mercaptodecanoic asit (MUA) içindeki bir 1 mM'lik bir çözelti hazırlayın. 10 dakika süre ile sonikasyon. 48 saat MUA çözümünde uygun nanoyapılı substratı daldırın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca üç kez etanol ile ve kuru örnek yıkayın. (3- (dimetilamino) propil) karbodiimid (EDC), deiyonize suda – N-etil-N ', 75 mM'lik bir çözelti hazırlayın. DI su N-hidroksisukinimid (NHS) 15 mM çözeltisi hazırlayın. Substrat üzerinde Au ile ilgili bir mikropipet depozito NHS 100 ul kullanarak, hemen aynı alanda EDC 100 ul ekleyin. Kendinden düzenlenen tek tabaka MUA (SAM) aktif hale getirmek için, 1 dakika süreyle inkübe edin. Bir protein, 100 ul damla alt-tabaka, aynı alan üzerinde bir çözeltisi (47 uM), koyun ve bir çok bölmeli bir Petri d, 5 ° C'de 24 saat boyunca örneği saklamakBaşka bir bölme DI 1 ml su ile ish ve sızdırmaz bir kapak. Sürekli her beher 20 sn için ayrı kap örnekleri karıştırılarak DI su içinde örneklemin 3 kez durulayın. Numuneler durulama sonra veya durulama sırasında kurumaya izin vermeyin. 5. adıma geçin. Tasarım 2 örnekleri hazırlayın: Potasyum fosfat tampon maddesi glikoz bağlayıcı protein (GBP) içindeki bir 0.9 mM solüsyonu (K 2 HPO 4, 25 mM, pH 7.5) hazırlayın. Tampon D-glikoz, 100 mM'lik bir çözelti hazırlayın. 100 mM D-glikoz çözeltisi 30 ul ve 1 ml'lik plastik Mikrotüp kap ve bir mikropipet kullanılarak 0.9 mM TRY çözeltisi 30 ul karıştırın. 30 dakika boyunca inkübe edin. Mevduat ligand-serbest GBP çözeltisi ve bir mikropipet kullanılarak hazırlanmış yüzeylerde ligand bağlı GBP solüsyonu her 20 ul. Kapalı bir kapak ile bir Petri kabı içinde 24 saat boyunca 5 ° C'de örnekleri saklayın. Numuneleri 3 kez durulayınoda sıcaklığında potasyum fosfat tampon çözeltisi. 5. adıma geçin. Tasarım 3 örnekleri hazırlayın: 7.4'luk bir nihai pH'a sahip TRIS EDTA tamponu kullanılarak 1 uM bir konsantrasyona kadar dopamin aptamer bağlayıcı (dba) çözeltisi ile seyreltilir. Bir analitik terazi üzerinde, dopamin tozu ölçmek ve 5 dakika süreyle bir karıştırma boncuk ile fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde karıştırılarak, 5 uM konsantrasyonda bir dopamin çözelti hazırlayın. Her bir alt-tabakanın yüzeyi üzerinde DBA çözeltisi 20 ul damla yatırın ve numuneler Petri kabı üzerinde bir kapak ile oda sıcaklığında 1 saat bekletin. Numuneler, bir potasyum fosfat tampon maddesi içinde 3 kez (K 2 HPO 4, 25 mM, pH 7.5) yıkayın. Dik bir temiz oda notu üst numuneler alt-tabakanın ön tarafında bir film korurken ters kuru silin. Bir kontrol olarak kenara bir örnek ayarlayın. Dopamin çözümü o bir 5 ul damla yerleştirinn, arzu edilen dopamin konsantrasyonları ile geri kalan numuneler üzerinde PBS tampon çözeltisi mevcut damla yüzeyi. 10 dakika boyunca numune inkübe edin. Aptamer olmadan Au yastık balata yüzeyi, dopamin bir çözelti damla yerleştirin. 10 dakika boyunca inkübe edin. Potasyum fosfat tampon çözeltisi içinde 3 kez örnekleri durulayın. 5. Raman Spektroskopisi Lazer maruz buharlaşmayı önlemek için bir su geçirmez bölmesi içinde her bir örnek yerleştirin. Cam slaytlar kimyasal olarak inert yüksek vakum gres, yer örnekleri ile bir plastik şırınga doldurun ve örnekleri dokunmadan örnekleri çevreleyen yağ bir kaç milimetre dağıtmak. Tampon vakum yağ ile temas için izin vermeden substratlar ve lamelleri arasında ince bir sıvı ara birim oluşturarak bir yalıtım oluşturmak üzere bastırın hafifçe alt tabakalar üzerine bir mikroskop lamel yerleştirin ve. KullanmaOptik Raman mikroskobu sistemi, lazer açmadan numune alınacak, metal nano-desenli bölgenin yüzeyinde bir odak edinin. 10X büyütme hedefi ile numune zarar görmesini önlemek için en az 20 sn toplam süresi 2,4-3,1 mW arasında bir lazer yoğunluğu Raman örnekleme 18,19 gerçekleştirin. Tablo 1 'de gösterildiği gibi. Uyarım dalga boyları kullanılarak Designs, 1, 2, ve 3 arasından örnekler için Raman Elde da proteini A, GBP ve D-glikoz ve dopamin tozu, metal olmayan cam slaytlar kullanılarak çözümü için kontrol Raman elde gibi nano karşılaştırma için destekler.

Representative Results

Çözelti içinde serbest proteinler ve metal içeren substrat kullanmadan çözelti ya da toz biçiminde serbest ligandlar da dahil olmak üzere, ana bileşenler için kontrol Raman Toplama, yorumlama amaçlı olarak uygun bir karşılaştırma yapabilmek için çok önemlidir. Şekil 5A, tipik bir Raman sunulur nanoyapılı yüzeylerde olmadan cam slayt DI su içinde serbest protein A spektrum. En yüksek Raman yoğunluğu ile iki bant, 2931 cm bant -1 ve 1,091 cm -1, sırasıyla, CH ve CS bağları içeren titreşimlere karşılık gelmektedir. 563 cm-1, 1450 cm-1, 1653 cm-1 ve 2426 cm-1 gibi bir düşük değerli Raman yoğunluğu olan diğer gruplar, titreşim modları 18,32,33,34 bir üstüste atfedilebilir. Üç farklı konsantrasyonda, 0.3, 0.9 ve 1.3 mM tampon çözelti içinde ligand serbest GPB Kontrol Raman spektrumları, Şekil 5B'de gösterilmektedir. T O 2.935 cm bant ise, çözücü 35 geniş bant etrafında 3,400 cm -1 karşılık, anlamaya -1 32,33. Şekil 5C D-glikoz yüksek dalga boyu Raman spektrumunu göstermektedir protein CH bağları içeren titreşimleri temsil 1, 6, 100, 200 ve 400 mM: Farklı konsantrasyonları için tampon çözeltisi. Glukoz konsantrasyonu artar, CH bağlarının titreşim bantları 2890 cm-1 ve 2960 cm-1 ortaya çıkmaktadır. Her ikisi de 532 nm ve 780 nm eksitasyon dalga boyu ile elde edilen kristal halinde dopamin kontrol Raman spektrası Şekil 5D'de gösterilmiştir. Raman spektrumunun Çok bükme ve molekülün 19,36 CH bağı uzanıyor benzen halkası geliyor. 3.000 cm -1 bantların bazıları yalnızca 532 nm gözlenen ancak 780 nm uyarma dalga boyu vardır. pload / 52.712 / 52712fig5.jpg "/> DI su içinde protein A'nın Şekil 5. Kontrol Raman tayfı 532 nm eksitasyon dalga boyu 18 (A) elde edilmiştir; Tampon çözelti içinde ligand içermeyen glikoz bağlayıcı proteinin Raman spektrası 532 nm eksitasyon dalga boyu (B) 'de elde edilen; Tampon çözelti içinde D-glükoz Raman spektrası 532 nm eksitasyon dalga boyu (C) elde edilen; ve dopamin tozu spektrumları 532 nm ve 780 nm dalga boylarında uyarım 19 (D) elde edilmiştir. Tüm spektrumlar, düzenli çözeltiler Raman spektrası nano yapılı alt tabakalar olmaksızın, cam sürgüler üzerindeki (a, b, c) ve toz (D) 'dir. (D), çeşitli moleküler titreşimler Raman vardiya rejimlerin atama başka 19 ayrıntılı olarak Genel Atom ve Molekül Elektronik Yapı Sistemi (GAMESS) 30 ve MacMolPlt 31 yazılımı kullanılarak yapıldı. 18 Americ izni ile yayımlanmaktadır paneli (a)Bir Vakum Derneği. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Adım 1-3 de tarif edildiği gibi yüzey-hareketsizleştirilmiş biyomoleküllerin için SERS spektrumunu elde etmek için, erimiş silis destek üzerinde metalik oluşturulan nano içeren alt-tabakalar imal edilmiştir. Fabrikasyon yüzeylerde kalitesi taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak izlenir. Standart SEM prosedürler başka 16,17,18, 19 tarif ve mevcut protokol dahil değildir. 6 temsilci SEM Au ve Ag nano-nokta ve yapılar (paneller reklamın) gibi nano-altıgen görüntüleri, yanı sıra sigara gibi göstermektedir -structured Au, Ag pedleri (sırasıyla Panel E ve F). Bir sonraki adımlar, biyolojik Tablo 1'de listelenen üç tasarımlar kullanılarak nano-yapılı yüzeylerde malzeme ve onların SERS spektrumları edinimi immobilizasyonunu içerir. O da Raman görüntüleme sırasında, sulu bir ortam sağlamak için, order, her bir numune karşılık gelen bir çözeltiye yerleştirilmiş olan Şekil 7'de gösterildiği gibi, ince bir cam kapak ile kapatıldı ve kapalı (Tablo 1 e bakınız). Şekil 6. Tarama elektron mikroskobu (SEM) SERS substrat olarak kullanılan 10 nm kalınlığında Au ve Ag yüzey nanoyapılarda görüntüleri: (A, B) nanodots dizileri; (C, D), nano-altıgenler dizileri; (E, F) yapılandırılmamış yastıkları. Ag yapıları (sağda) ile yüzeylerde FS üzerinde 10 nm kalınlığında Ni kaplama kullanmak ise Au yapıları ile Yüzeyleri (solda), FS destekleri kullanır. başka yerde 16,17,18 açıklandığı gibi görüntüler elde edilmiştir.pg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. Şekil çözeltisi içinde biyo-Fonksiyonlu örneklerin Raman görüntüleme için su geçirmez odanın 7. Şema. Tasarım 1 'de, bir araya getiren protein bir DI su 18 11-mercaptodecanoic asit (MUA) bir kendi kendine bir araya tek tabaka ile işlevselleştirilmiş alt tabakalar üzerinde immobilize edilir. Bu tasarımda alt tabakalar 50 mil zift ve kaynaşık silika üzerinde değişen arası nokta mesafeleri (Şekiller 6A ve 8) ile birlikte, Au nokta üç dizileri ihtiva eder. Protein hareketsizleştirme işlem alt tabakalar üzerinde, bir SAM oluşumu başlar. SAM ve protein arasındaki bağlanma kovalent elde edilmesi için, SAM ve karboksilik asit grupları, N içeren bir karışım ile muamele ile amin reaktif NHS-ester dönüştürülmüştür </em>-etil-N '- (3- (dimetilamino) propil) karbodiimid (EDC) çözeltisi ve DI suyla, N-hidroksisukinimid (NHS) çözeltisi eklenmiştir. Protein A immobilizasyonu proteininin 37 lizin kalıntıları NHS grubunun yer değiştirmesi ile meydana gelir. Au nanoyapılarda üzerinde hareketsiz hale getirilmiş protein A Design 1 görüntüleme örneklerinin bir örneği, Şekil 9'da gösterilmiştir. (Bakınız Şekil 9A, farklı arası nokta boşluklar biyo-işlevselleştirilmiş Au nanodots üç dizileri ihtiva örnekleri, bir optik mikroskop görüntüsünü sunar Ayrıca 3AA ve 8) Şekil ve Şekil 9B bu diziler üzerinde Raman spektral haritalama gösterir. En yüksek Raman şiddetleri Array alt yoğunlukları geniş arası nokta boşluklar Array III elde edilir ise arası nokta boşluklar, dar I bulundu olduğu görülebilir. Bu, daha yüksek elektrik bes tarafından üretilen güçlü bir plazmon bağlama etkisiyle açıklanabilirnoktalar arasındaki dar alanlarda LDS 18. Şekil 9C Diziler I ve II için elde edilen güçlü SERS spektrumları gösterir. spektrumları Şekil 5A'da görüldüğü çözelti içinde serbest protein A Raman modları yakınında çeşitli bantlar (1630 cm-1, 1964 cm-1, 2280 cm-1, 2577 cm-1 ve 2916 cm-1) bulunmaktadır. Proteinlerde bulunan çeşitli bağların titreşimleri Atfedilen, bu bantlar hem hareketsiz protein benzer yerlerde ve çözüm görünür, ya da hareketsiz hafifçe biraz daha yüksek dalgasayıları kaymıştır ya. Buna karşılık, protein olmadan MUA SAM tarafından işlevselleştirilen benzer nanoyapılı yüzeylerin SERS spektrumları o Şekil 9 teyit tamamen farklı bir desen 18 göstermek yüzey hareketsiz protein A SERS haritalama temsil eden bir görüntülemek için buraya tıklayınız Bu rakamın büyük versiyonu. Şekil Tasarımı 1 18 kullanılan FS substrat Au nanodots üç dizilerin 8. SEM görüntüleri. Diziler aynı 50 nm sahayı ve inter-nokta boşluklar farklı genişlikte sonuçlanan biraz farklı nokta yarıçapı. Bu üç diziler için PMMA maskeleri üretmek için farklı EBL maruziyet dozu uygulanarak elde edilir (Tablo 1). Yüksek pozlama dozları metal kaplamaya ve Fırlatmaya sonra büyük Au nokta boyutları için izin PMMA maskeleri daha geniş delikler açar. 18 Amerikan Vakum Derneği izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. les / ftp_upload / 52.712 / 52712fig9.jpg "/> Tasarım 1 18 alt tabaka hareketsiz protein A Şekil 9. SERS görüntüleme. Bir erimiş silika substrat üzerinde 50 nm perde ve farklı arası nokta boşluklar Au nanodots üç dizileri içeren (A) numunenin optik mikroskop görüntüsü, (ayrıca bkz Şekil 6), biyo-işlevselleştirilmiş Şekil 3A'da gösterildiği gibi. (B), örnek Raman haritalandırılması. Nokta Array I ve II (C) SERS spektrumları. Panelin (B), dikey eksen alt tabaka arasında mesafe, yatay eksen kayması Raman temsil eder, ve efsane çubuğu Raman yoğunlukları gösterir. Dikey panelinde panellerde hatları (B) ve (C) çözeltisi ve serbest protein A'nın karşılaştırmalı Raman bandı gösterir (*) kesik (C) Dizi I Raman spektrumları SERS bantları gösteren 532 nm uyarma elde edilmiştirdalga boyu. 18 Amerikan Vakum Derneği izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Tasarım 2'de, yeniden birleştirici glukoz bağlama proteini (TRY) 21 D-glikoz (ligand) ile kompleks hale getirilmiş potasyum fosfat tampon çözeltisi içinde uygun alt-tabakaların üzerine immobilize edilir. Hareketsizleştirilmiş ligand içermeyen GBP numuneler de karşılaştırma için hazırlanır. Bu tasarımda, glukoz-bağlama proteini soy metaller 6 iyi Ni ancak bağlanan bir histidin etiketi vasıtası ile yüzey bağlanır. Yüzeyler Ni kaplamalı FS Ag dizileri nano-nokta, nano-altıgenler ve yapılandırılmamış Ag pedleri ihtiva beri (Şekil 6B, 6D ve 6F, sırasıyla), bir immobilize protein moleküllerinin çoğu arasında boşluklar bulunan bekleyebilirsiniz Ni kaplama av olduğu Ag nanoyapılardaailable. Raman spektrumları elde edilen hareketsizleştirilmiş glükoz ve glükoz bağlı TRY sırasıyla Şekil 10A ve 10B, gösterilmiştir. Tüm bu spektrumları sergi tampon çözeltisine 35 tekabül geniş bant yaklaşık 3.300 cm -1. Bir yapılandırılmamış Ag ped ile elde edilen spektrumları sadece bu tek bant içerir ve beklendiği gibi immobilize protein Ag yüzeyinde bulunan olmadığını teyit herhangi bir protein titreşim modları görünmüyor. Buna karşılık, spektrumları analit 32,33 temsil 1.550 cm -1 ve 2.900 cm -1 civarında Ag nano-nokta ve nano-altıgen sergi bantlar dizileri, elde edilen. Özellikle, geniş bant etrafında 1.550 cm -1, amid II bant olarak bilinen, proteinler 33,34 tahvil titreşimleri peptid bağlanabilir. Bu vakada, bu grup Ag özelliği arasındaki Ni yüzeyi üzerinde hareketsiz GBP titreşim modlarının bir üstüste binişini göstermektedirNano-nokta ya da nano-altıgen ihtiva eden alt-tabakalar kullanıldığında ler ve asil metal nano yakın Bu modların SERS geliştirme göstergesidir. Bu bant bağlama proteini için Ni yüzeysiz Ag ped üzerinde mevcut SERS geliştirilmesinde uygulanmıştır (Şekil 5B) ve yokluğunda çözeltide proteini için çok zayıf olan, ancak, protein için erişilebilir bir miktar Ni yüzeyi ile nano yapılı alt tabakalar için telaffuz edilir bağlamak. Ancak, hatta daha önemli bu çalışma için diğer dar bantlar çapında yaklaşık 2.900 cm -1 32,33 wibrations CH bağı isnat edilebilir bulunmaktadır. glikoz içermeyen GBP spektrumu 2933 cm -1 nano-altıgen alt tabaka (Şekil 10A) ile benzer bir dalga boyunda nano-noktalar substrat ve zayıf ama fark edilebilir bant ile en belirgin bant gösterir. Glikoz serbest protein durumunda farklı, glikoz bağlı GBP SERS spektrumları figu gösterilen 10B sergileyin 2,850 cm -1 ve 2.910 cm -1 de, tahvil titreşimleri rejimleri CH gelen iki bant yeniden. şeritler de nano altıgenler alt-tabaka üzerinde glukoz bağlı GBP spektrumunda belirgindir, ve ayrıca nano nokta alt-tabaka üzerinde GBP spektrumunda görülebilir. 2850 cm bant -1 diğer grup ise (2.910 cm, 2890 cm oldukça yakın -1 tek bir çözelti içinde, D-glikozdan, kontrol Raman spektrumunda olan ve bu nedenle, proteine bağlı glukoz atfedilebilir -1) protein ve glikoz hem de CH bağı titreşimleri bağlanabilir. Bir glikoz serbest ve glikoz-bağlı Substratla hareketsizleştirilmiş GBP SERS imzaların bu fark sonucuna bu bölgede gözlemlenebilir ve proteine bağlı glikoz CH bağ titreşimleri tarif edilen bir tasarım kullanılarak tespit edilebilir. 10.jpg "/> Ligand-ücretsiz (A) ve Tasarım 2 üç farklı yüzeylerde immobilize. Spektrumları 780 nm dalgaboyu ile elde edilmiştir ligand bağlı (B) glukoz-bağlayıcı protein. Şekil 10. SERS spektrumları daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın. Design 3 de, tiol sonlandırma 23, özel dopamin bağlama aptamer (dba) tris alt-tabaka (hidroksimetil) aminometan (TRIS), etilendiamintetraasetik asit (EDTA) tampon çözeltisi üzerinde immobilize edilir ve dopamin sonra hareketsiz kılınmış aptamer 19 bağlıdır. Bu tasarım için yüzeyler FS (Şekil 6C) Au nano-altıgen diziler içerir. Yapılandırılmamış Au yastıkları (Şekil 6E) de kontrol amaçlı kullanılır. DNA, doğal olarak floresan olduğu 38, 780 nm eksitasyon waveleng th Bu faktörü azaltmak için Tasarım 3 kullanılır. Dopamin, bu bölgede önemli bir Raman aktivitesi gösterirken, bu tasarımda, tanıma elemanı (aptamer), Şekil 11 'de ele Raman kaymaların bölgesinde aktif Raman değildir. Hareketsiz aptamer olmadan sadece dopamin maruz kalan numunelerin sinyal yok sonuçtaki dopamin bantları 19 gösterir görüldüğünden, SERS bantları Şekil 11. Aptamer bağlı dopamin kaynaklandığı tahmin öncesi ve ilavesinden sonra altın nanoyapılarda üzerinde hareketsiz aptamer SERS spektrumları karşılaştırır edilir Dopamin. Beklendiği gibi, hareketsiz dopamin Aptamer Raman bandı göstermez. Buna karşılık, telaffuz Raman bantları bir dizi dopamin bağlı immobilize aptamer gözlenmektedir. Şekil 11 en gruplarından pozisyonları amplitüdlerinde farklılıklar ile de olsa, kristal dopamin olanlara yakındır. igure 11 "src =" / files / ftp_upload / 52.712 / 52712fig11.jpg "/> Ligand-serbest (mor çizgi) ve ligand bağlı (mavi çizgi) dopamin-bağlama Tasarım Au nano-altıgen yüzeyler üzerinde hareketsiz aptameri 3 19. Kırmızı çizgi dopamin toz kontrol SERS spektrumunu göstermektedir. Şekil 11. SERS spektrumları Lütfen Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Discussion

SERS birçok benzersiz avantajlar sunan biyo-algılama son derece güçlü bir teknik olarak bir tanıma kazanıyor. Son derece yüksek hassasiyet analitin ^9,10,11,35 çok küçük miktarlarda tespit mümkün kılan ise moleküler titreşimler ile ilişkisi seçici, SERS spektrumları belirli Analitlerin "parmak izi" tanımlayan sağlar. Ayrıca, SERS suyun nispeten hassas olmayan bir geri dönüşlü bir tekniktir, ve bu şekilde çok iyi doğal sulu ortam ⁹ biyolojik malzemeler tarama için uygundur. Sunulan sonuçlar bu avantajlar yanı sıra biyo-algılama çok esnek etiket serbest teknik olarak sers güçlü potansiyelini göstermek vurgulamak. Farklı substrat-hareketsiz biyomoleküllerin monokatmanlar kullanan üç tasarımlarda, Raman modları güvenle belirli analitlerden isnat edilebileceği tespit edilmiştir. İşte bu biyomoleküllerin, tespit or kendi ligandlar, SERS yüzeyler için destek olarak erimiş silis düzlemsel yüzeyleri kullanılarak gösterilmiştir, elektronik yüzeyleri ile biyolojik malzemeler arabirim biyo-elektronik mimarileri ortaya çıkan ilişkin sayısız uygulamaları umut verici, mevcut elektronik ve Mikroakiskan ayarları ile uyumlu tasarımlar yapar ve elektrokimyasal cihaz ^2,3. Önemli bir şekilde, iki ya da üç tasarımlarında SERS algılama tanıma elemanları olarak, glukoz ve dopamin, sırasıyla yüzey-hareketsiz hale getirilmiş proteine ve aptamer, tek tabakaları kullanmak gibi küçük moleküllerin spesifik bağlanması için gösterilmiştir.

Ancak, çeşitli yönleri "on-chip" bir ortamda verimli bir SERS biyo-algılama ulaşmak için dikkat alınmalıdır. Her şeyden önce, en biyomoleküllerin için ortak olan iyi bilinen bir sorun da kuru ENVI gibi doğal olmayan koşullara maruz özellikle, parçalama eğilimidirlanmaktadır veya yoğun lazer ışığı. Protokol boyunca, her zaman Raman satın numunelerin hazırlanmasından, tüm deney sırasında uygun çözümler dalmış biyo-Fonksiyonlu örnekleri tutmanın önemini vurgulamışlardır. İkincisi için, özel bir su geçirmez bölme lazer maruz sırasında sıvı buharlaşmasını önlemek için (Şekil 7) dizayn edilmiştir. Numunelerin zarar görmesini önlemek için bir protokol aşama 5.3'de tarif edildiği gibi maruz kalma ve lazer yoğunluğu süresi de sınırlı kalmalıdır.

SERS algılama sonuçları kullanılan substrat ve metalik nano özellikle arası özelliği ayırma geometri duyarlı bulunmuştur. Bu, Şekil 8 ve 9'da görülebileceği gibi, tasarım 1 numune SERS yoğunluğu, erimiş silis Au nano noktalar arasındaki boşluklar genişliğine kuvvetle bağlıdır. Au nanodots Out üç dizileri i testn bu tasarım (Şekil 8), en yüksek Raman yoğunluğu Au özellikleri arasında dar boşluklar vardır ve bu nedenle daha verimli elektromanyetik alan geliştirme sağlayan Array ben, ile elde edilir. Şekil 9 itibarıyla, 10-20 nm ya da daha düşük düzeyde arası özelliği ayrılmaların kontrol gerekmektedir. SERS alt tabakaların imalatı için EBL çalışanı, burada gösterildiği gibi, arası özellik boşluklar genişlikleri kontrol için özel bir etkin çözünürlüğü sağlar. Pozitif ton 'ü ile PMMA gibi karşı PMMA maskeleri delik boyutu sadece maruz dozlarım değiştirmek suretiyle değiştirilebilir. Asansör-off sonra bu fabrikasyon metal nokta farklı boyutlarda sonuçları ve ¹⁸ dozlar uygun EBL pozlama seçerek istediğiniz gibi noktalar arasındaki boşlukların genişliği ayarlı olabilir.

Diğer meydan özel biyo-algılama uygulaması için SERS substrat geometri optimizasyonu. Geliştirme etkisi i rağmenarası özellik boşlukları bir azalma ile ncreases, biyolojik moleküllerin nispeten büyük boyutlu boşluklar olabilir ne kadar dar sınırlamalar getirmektedir. Bu ancak nokta kendileri (Şekil 3B) için bir hareketsizleştirme yöntemi, proteinin etkin bir şekilde sadece soy metal noktalar arasındaki yüzeyine bağlanır şekildedir Design 2 için sonuçlarından açıkça görülmektedir. Şekil 10 ile ilgili, aşağıdaki gibi, yapısal olmayan Ag pedler için SERS spektrumu analit ile ilgili bir bant göstermezler. Pedler çok ince ada içi boşlukları ile nano-kristal yapısını sergileyen rağmen bu boşluklar bir protein molekülünü karşılamak için çok dar (Şekil 6F bakınız). Yine karmaşıklık başka boyut, protein-ligand bağlanma tespit edilecek olduğunda ilave edilir. Şekil 10'da, SERS CH bantları varsayımsal GBP konformasyonda bir değişiklik ile açıklanabilir bağ içermeyen bir daha ligand-bağlı reseptör GBP spektrum, daha belirgin olarakD-glikoz ^{2 7,27} arasında artan bağlama Raman etkinliği olan daha sert bir yapı elde üzerine. Bir iki nanoyapılı yüzeylerde, ligand-serbest protein CH bandı ligand bağlı protein protein ve glikoz CH bantları hem nano-altıgenlerle daha belirgin iken, nano-nokta alt tabaka ile elde edilen SERS spektrumları güçlü karşılaştırır ise alt-tabaka. İki faktör bu farklılıkların neden bekleniyor, Ag arasındaki boşluğun kullanılabilirliği TRY Ni bağlamak nerede özellikleri ve "sıcak noktalar" saçılma Raman elektromanyetik donanım için ligand bağlı ve ligand serbest protein duyarlılık Bu özellikler arasında yer almaktadır. Bir yandan, nano nokta desen proteini Ag nano nokta alt-tabaka üzerinde glikoz içermeyen GBP gözlemlenen daha belirgin bir CH grubu açıklayabilir, bağlamak amaçlı Ni kaplamalı mevcut olan nispeten daha büyük arası özelliği alanı sunmaktadır. Öte yandan, her ne kadar tek tip yapısına ait nedeniyleTure (Şekil 6D bakınız), Ag nano-altıgen nano-altıgen alt tabaka üzerinde glukoz bağlı GBP daha güçlü CH titreşim bantları sonuçlanan nano-altıgen içinde Ag adalar arasındaki dar boşluklar daha güçlü elektromanyetik artış göstermeyen eğilimli olabilir. Bu etkileşim bazı detayları ek doğrulama gerektirir ve bu GBP gibi büyük proteinleri içeren karmaşık analitlerle için SERS yüzeylerde optimizasyonu boru hattı hala.

Diğer bileşenler değildir oysa sadece ligand seçilen bölgede faaliyet Raman olduğunda Açıkçası, bir tanıma elemanı olarak hareketsiz biyomoleküllerin istihdam bağlayıcı ligand SERS algılama kolaylaşır. Bu aptamer bağlı dopaminin belirgin SERS bantları elde edilir Design 3, (Şekil 11) durumudur. aptamer-dopamin çifti mükemmel özgüllük sergiler ve SERS spektrumu önemli arka plan sinyali olmadan belirgin bantları içermektedir.

<p class="jove_content"> Etiket ücreti SERS teknolojisinin Gelecek peşin farklı yüzey nanoyapı tasarımları geniş bir yelpazesi ile biyomolekülleri 'SERS sinyal artışının kapsamlı testler yer alacak. Doğrudan yazma elektron demeti litografi kullanımı, burada sunulan örnek hazırlama protokolleri ile birlikte, boyut, şekil ve inter-özelliği ayrılması üzerinde kontrol mükemmel seviyede çeşitli nanoyapıları imal sonuçların karşılaştırılması ve çapraz-doğrulama elde kolaylaştıracak farklı araştırma grupları tarafından. SERS yüzeyler yöntemleri ^11,12,13 "aşağıdan yukarıya" alternatif istihdam fabrikasyon Bu geniş bir yelpazede için optimum substrat tasarım güvenilir bir kimlik doğru metal nano boyutu ve konumu daha iyi kontrol sağlayan, tekrarlanabilirlik büyük meydan ele alınacak uygulamaları. Bu tekniklerin ölçeklenebilirlik daha sonra, nano tamamlayıcı Nanolitografi yöntemlerle EBL birleştirilmesiyle geliştirilebilirNano ölçekli tasarımları gelecek seri üretime yönelik künye litografi ¹⁹ ayarlanabilir EBL teknikler kullanılarak optimize.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank: David Wishart, Valentyna Semenchenko, Mark McDermott, Michael Woodside, and Albert Cao for their help in developing and preparing the protein conjugates as well as the DNA aptamer; T. M. Fahim Amin, Mosa Sharmin Aktar, and Trevor Olsen for their assistance in the sample preparation, Jonathan Mane for his assistance in generating images of the molecular structures; and the funding sources including the National Research Council of Canada – National Institute for Nanotechnology (NRC-NINT), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), and the University of Alberta for supporting the work.

Materials

11-Mercaptoundecanoic acid (MUA)	Sigma Aldrich (www.sigmaalrich.com)	450561 ALDRICH	Used for surface functionalization in Design 1
Conductive polymer	Mitsubishi Rayon (www.mrc.co.jp)	aquaSAVE-57xs	A 70 nm thick layer is used as anti-charging coating for EBL exposures
D-glucose	Collaborator Lab.		Ligand in Design 2
Dopamine	Collaborator Lab.		Ligand in Design 3
Dopamine binding aptamer (DBA)	Integrated DNA Technologies Inc. (www.idtdna.com)	5'- /Thiol Modifier C6 S-S/ AAAAAAAAAA GTCTCTGTGT GCGCCAGAGA ACACTGGGGC AGATATGGGC CAGCACAGAA TGAGGCCC-3'	Biopolymer in Design 3
Fused silica wafers	Mark Optics www.markoptics.com
Glucose binding protein (GBP)	Collaborator Lab. (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi\|145579532)	PDB ID 2HPH	Biopolymer in Design 2
High vacuum grease	Dow Corning (www.dowcorning.com)		Used to seal water-proof chamber, step 5.1
Hydrogen Peroxide 30%, H₂O₂	J.T. Baker		Used for pirahna solution, step 1.2
N-ethyl-N'-(3-(dimethylamino) propyl) carbodiimide (EDC)	Sigma Aldrich www.sigmaaldrich.com	03450 FLUKA	Used for immobilization of biopolymer in Design 1
N-Hydroxysuccinimide (NHS)	Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com)	130672 ALDRICH	Used for immobilization of biopolymer in Design 1
Potassium phosphate buffer	Collaborator Lab.		Buffer used in Raman sampling
Phosphate buffered	Collaborator Lab.		Solvent in Design 3
saline (PBS)
Polymethylmethacrylate (PMMA) 950 A2	MicroChem (www.microchem.com)		A 90 nm thick layer is used as EBL positive tone resist
Recombinant protein A	Protein Mods Inc (www.proteinmods.com)	PDB ID 1BDD (www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1bdd)	Biopolymer in Design 1
Sulfuric acid 96%, H₂SO₄	J.T. Baker		Used for pirahna solution, step 1.2
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) buffer	Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com)	T9285 SIGMA	Buffer in Design 3
Dicing saw	Diamond Touch Technology Inc.		Used to cut FS wafer, step 1.1
	(17301 W Colfax Ave # 152, Golden, CO)
Electron beam evaporator	Kurt J. Lesker (www.lesker.com)		Used for Au and Ag evaporation
Electron beam evaporator	Johnsen Ultravac (JUV) (www.ultrahivac.com)	JuV E-gun	Used for Ni evaporation
Microscope cover slips (25 mm)	Fisher Scientific (www.fishersci.ca)	12-545-102	Used in water-proof chamber, step 5.1
Microscope slides (3×1 in.)	Fisher Scientific (www.fishersci.ca)		Used in water-proof chamber, step 5.1
Raith 150^TWO EBL exposure system	Raith Inc. (www.raith.com)	Raith 150^TWO system	Used for EBL exposures, step 2.2
Raman microscope	Thermo Scientific (www.thermoscientific.com)	Nicolet Almega XR	Used for Raman spectroscopy, step 5.3
Sonicator system	Branson (www.bransonic.com)		Used for liftoff and solutions mixing
Spinner	Brewer Spinner and Hotplate (www.brewerscience.com)	Cee 200X and Cee 1300X	Used to spin-coat PMMA and conductive polymer, step 2.1

References

Sapsford, K. E., Tyner, K. M., Dair, B. J., Deschamps, J. R., Medlintz, I. L. Analyzing Nanomaterial Bioconjugates: A Review of Current and Emerging Purification and Characterization Techniques. Anal. Chem. 83, 4453-4488 (2011).
Walcarius, A., Minteer, S. h. D., Wang, J., Yu, L., Merkoçi, A. Nanomaterials for Bio-Functionalized Electrodes: Recent Trends. J. Mater. Chem. B. 1, 4878-4908 (2013).
Kim, J., et al. Applications, Techniques, and Microfluidic Interfacing for Nanoscale Biosensing. Microfluid. Nanofluid. 7, 149-167 (2009).
Rassaei, L., Singh, P. S., Lemay, S. G. Lithography-Based Nanoelectrochemistry. Anal. Chem. 83, 3974-3980 (2011).
Wong, L. S., Khan, F., Micklefield, J. Selective Covalent Protein Immobilization: Strategies and Applications. Chem. Rev. 109, 4025-4053 (2009).
Ley, C., Holtmann, D., Mangold, K. -. M., Schrader, J. Immobilization of Histidine-Tagged Proteins on Electrodes. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 88, 539-551 (2011).
Kim, D., Herr, A. E. Protein Immobilization Techniques for Microfluidic Assays. Biomicrofluidics. 7, 041501 (2013).
Anker, J. N., Hall, W. P., Lyandres, O., Shah, N. C., Xhao, J., Van Duyne, R. P. Biosensing with Plasmonic Nanosensors. Nature Materials. 7, 442-453 (2008).
Bantz, K. C., et al. Recent Progress in SERS Biosensing. Phys.Chem. 13, 11551-11567 (2011).
Sharma, B., Frontiera, R. R., Henry, A. -. I., Ringe, E., Van Duyne, R. P. SERS: Materials, Applications, and the Future. Mater. Today. 15, 16-25 (2012).
Kleinman, S. L., Frontiera, R. R., Henry, A. -. I., Dieringer, J. A., Van Duyne, R. P. Creating, Characterizing, and Controlling Chemistry with SERS Hot Spots. Phys.Chem.Chem.Phys. 15, 21-36 (2013).
Fan, M., Andrade, F. S., Brolo, A. G. A Review on the Fabrication of Substrates for Surface Enhanced Raman Spectroscopy and their Applications in Analytical Chemistry. Anal. Chim. Acta. 693, 7-25 (2011).
Cao, Y., Li, D., Jiang, F., Yang, Y., Zh, H. Engineering Metal Nanostructure for SERS Application. J. Nanomater. 123812, 1-12 (2013).
Glembocki, O., Rendell, R., Alexson, D., Prokes, S., Fu, A., Mastro, M. Dielectric-Substrate-Induced Surface-Enhanced Raman Scattering. Phys. Rev. B. 80, 085416 (2009).
Merlen, A., et al. Surface Enhanced Spectroscopy with Gold Nanostructures on Silicon and Glass Substrates. Surf. Sci. 605, 1214-1218 (2011).
Muhammad, M., Buswell, S. C., Dew, S. K., Stepanova, M. Nanopatterning of PMMA on Insulating Surfaces with Various Anticharging Schemes Using 30 keV Electron Beam Lithography. J. Vac. Sci. Technol. B. 29, 06F304 (2011).
Peters, R., Fito, T., Gutierrez-Rivera, L., Dew, S. K., Stepanova, M. Study of Multilayer Systems in Electron Beam Lithography. J. Vac. Sci. Technol. B. 31, 06F407 (2013).
Gutierrez-Rivera, L., Peters, R., Dew, S., Stepanova, M. Application of EBL Fabricated Nanostrucutred Substrates for SERS Detection of Protein A in Aqueous Solution. J. Vac. Sci. Technol.B. 31, (2013).
Gutierrez-Rivera, L., Peters, R., Dew, S., Stepanova, M. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Protein-Ligand Binding Using D-glucose and Glucose Binding Protein on Nanostructured Plasmonic Substrates. , (2014).
Peters, R. . Fabrication and Testing of Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Substrates for the Detection of Biomolecules [MSc Thesis]. , (2014).
Gouda, H., Torigoe, H., Saito, A., Sato, M., Arata, Y., Shimada, I. Three-Dmensional Solution Structure of the B Domain of Staphylococcal Protein A: Comparisons of the Solution and Crystal Structures. 生物化学. 31, 9665-9672 (1992).
Cuneo, M. J., Johnson, S. J., Beese, L. S., Hellinga, H. W. High Resolution Structure of E. Coli Glucose/Galactose Binding Protein Bound with Glucose. Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) Protein Data Bank. , (2009).
Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. VMD – Visual Molecular Dynamics. J. Molec. Graphics. 14, 33-38 (1996).
Walsh, R., DeRosa, M. C. Retention of Function in the DNA Homolog of the RNA Dopamine Aptamer. Biochem. Biophys. Res. Comm. 388, 732-735 (2009).
Akitomi, J., Kato, S., Yoshida, Y., Horii, K., Furuich, M., Waga, I. ValFold: Program for the Aptamer Truncation Process. Biomed. Inf. 7, 38-40 (2011).
Han, K., Lee, Y., Kim, W. PseudoViewer: Automatic Visualization of RNA Pseudoknots. Bioinformatics. 18, S321-S327 (2002).
Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic Binding Proteins: a Versatile Superfamily for Protein Engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14, 495-504 (2004).
Benson, D. E., Conrad, D. W. Design of Bioelectronic Interfaces by Exploiting Hinge-Bending Motions in Proteins. Science. 293, 1641-1644 (2001).
Bozic, S., Chorzempa, J. . Pirahna Cleaning. , (2011).
Mohammad, M. A. Raith 150TWO SOP. , (2011).
Schmidt, M. W., et al. General Atomic and Molecular Electronic Structure System. J. Comput. Chem. 14, 1347-1363 (1993).
Bode, B. M., Gordon, M. S. MacMolPlt: a Graphical User Interface for GAMESS. J. of Mol. Graph. Mod. 16, 133-138 (1998).
Bright, A., Devi, T. S. R., Gunasekaran, S. Spectroscopical Vibrational Band Assignment and Qualitative Analysis of Biomedical Compounds with Cardiovascular Activity. Int. J. Chem. Tech. Res. 2, 379-388 (2010).
Bandekar, J. Amide Modes and Protein Conformation. Biochim. Biophys. Acta. 1120, 123-243 (1992).
Barth, A., Zscherp, C. What Vibrations Tell About Proteins. Quarterly Reviews of Biophysics. 35, 369-340 (2002).
Chrimes, A. F., Khoshmanesh, K. h., Stoddart, P. R. M. i. t. c. h. e. l. l. A., Kalantar-Zadeh, K. Microfluidics and Raman Microscopy: Current Applications and Future Challenges. Chem. Soc. Rev. 42, 5880-5906 (2013).
Park, S. -. K., Lee, N. -. S., Lee, S. -. H. Vibrational Analysis of Dopamine Neutral Base based on Density Functional Force Field. Bull.-Korean Chem. Soc. 21, 959-968 (2000).
Briand, E., Salmain, M., Compère, C., Pradier, C. M. Immobilization of Protein A on SAMs for the elaboration of immunosensors. Coll. Surf. B: Biointerfaces. 53, 215-224 (2006).
Lakowicz, L. R., et al. Radiative decay engineering: 2. Effects of Silver Island Films on Fluorescence Intensity, Lifetimes, and Resonance Energy Transfer. Analytical biochemistry. 301, 261-277 (2002).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Peters, R. F., Gutierrez-Rivera, L., Dew, S. K., Stepanova, M. Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Biomolecules Using EBL Fabricated Nanostructured Substrates. J. Vis. Exp. (97), e52712, doi:10.3791/52712 (2015).