Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Biomolecules Using EBL Fabricated Nanostructured Substrates

Robert F. Peters; Luis Gutierrez-Rivera; Steven K. Dew; Maria Stepanova

doi:10.3791/52712

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工程学

표면 EBL 날조 된 나노 구조 기판을 사용하여 생체 분자의 라만 분광학 감지 강화

Published: March 20, 2015

doi:

10.3791/52712

Robert F. Peters^1,2, Luis Gutierrez-Rivera^1,2, Steven K. Dew^1,2, Maria Stepanova^1,2

¹Department of Electrical and Computer Engineering,University of Alberta, ²National Institute for Nanotechnology,National Research Council of Canada

Summary

We describe the fabrication and characterization of nano-biological systems interfacing nanostructured substrates with immobilized proteins and aptamers. The relevant experimental steps involving lithographic fabrication of nanostructured substrates, bio-functionalization, and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) characterization, are reported. SERS detection of surface-immobilized proteins, and probing of protein-ligand and aptamer-ligand binding is demonstrated.

Abstract

제조 및 고정화 생체 분자와 고체 지지체에 금속 나노 구조의 인터페이스 복합 나노 생물 시스템의 특성가보고됩니다. 관련 실험 단계의 전체 시퀀스 전자선 리소그래피, 기판 상에 생체 분자의 고정화를 이용한 나노 기판의 제조를 포함하는, 제 42 및 특성화 이용한 표면 증강 라만 분광 (SERS). 나노 생물 시스템의 세 가지 다른 디자인은 단백질, 포도당 결합 단백질과 도파민 바인딩 DNA 앱 타머를 포함하여 사용된다. 후자의 두 경우에서, 각각의 리간드, D- 글루코스 및 도파민의 결합도 포함된다. 생체 분자의 3 종류가 다른 방법에 의해 기판 상에 나노 구조를 고정화하고, SERS 촬상의 결과가보고된다. SERS의 기능면에서의 단백질 고정화 진동 모드를 검출뿐만 아니라, 단백질 – 리간드를 캡처D 압 타머 – 리간드가 입증되는 바인딩. 결과는 또한 표면 나노 형상, 생체 분자를 고정화 전략 분자 취득한 SERS 스펙트럼에 리간드 결합의 유무 라만 활성의 영향을 도시한다.

Introduction

고체 나노 구조 생체 고분자의 인터페이스 복합 나노 생물 시스템을 개발하고 특성화하는 기능은 차세대 바이오 센서 및 바이오 작동 기술 ^{1, 2에서} 더욱 진보 점점 더 중요 해지고있다. 이것은 적절한 고체 성분 (마이크로 또는 나노 전극, 나노 공학 코팅, 나노 와이어 또는 나노 입자) ^2,3,4의 제조 등 연구 분야의 숫자에 걸쳐 다양한 분야의 연구를 포함한다; 원하는 bioconjugates ^5,6,7을 만들 수있는 표면에 생체 분자의 고정화; 나노 생물 인터페이스 ^1을 모니터링. 대부분의 경우, 최적 제조, 바이오 기능화 및 특성화 방법의 선택은 강하게 상호 관련된다. 분명히, 나노 기술의 선택은, 시스템의 고체 성분의 요구에 의해 구동 될 검출 방법에 크게 의존하는 TU에서RN 관련된 생체 고분자의 특성 및 인터페이스를 모니터링 용도에 의해 결정된다.

bioconjugate ^{시스템, 3,} 표면 강화 라만 분광법 (SERS)의 특성을 적용 다양한 기술 중 표면 ^8,9,10,11에 화학 및 생물 종의 검출을위한 매우 유망한 방법으로 떠오르고있다. SERS는 분자 진동에 해당하는 고유 한 서명의 캡처를 허용 표면 고정화 생체 분자 (그림 1)에 의해 단색광의 비탄성 산란을 사용합니다. 이 기능은 라벨, 화학 복합체 또는 시간 소모적 인 단계를 포함하지 않고 다른 분자에 구별 SERS에게 생체 검출의 가능성이 매우 효율적인 방법을 만든다. SERS의 또 다른 중요한 장점은 감도이다. 귀금속 나노 구조 (SERS 기판)과 상호 작용하는 빛에 의해 국소 표면 플라즈몬의 여기 극적 INT 증가라만 단층에서 단일 분자 ^8,9,10,11 한도까지, 분자의 아주 작은 양의 검출을 가능하게하여 검체의 산란 ensity. 마지막으로, 대부분의 생체 분자가 안정 수성 솔루션을 필요로한다. 물은 종종 제한된 라만 활성을 갖기 때문에, 수성 시료에서 배경 신호는 ⁹ 최소화된다. SERS의 응용 프로그램은 지난 십 년간 ¹⁰ 지수 증가를 전시했다. 그러나, 다량의 SERS 논의 과제는 라만 산란의 향상이 전자기 파들 ^{11,12,13 플라즈몬을} 유도 금속 나노 구조의 크기, 형상 및 간격에 따라 크게 달라진다는 것이다. 기판의 형상은 나노 사이즈로 필요 통해 효율적이고 재현 SERS 측정을 달성하기 위해, 제어한다.

그림 1. 사우스 캐롤라이나표면 증강 라만 분광 헴.

^11,12,13 SERS ^기판을 제조하는 수많은 방법이 이용 대략 상향식 하향식 방법으로 분류 될 수있다. 제 1 타입의 방법은 자기 조립 나노 구조물을 제조에 관한 화학 합성의 다양한 프로세스를 사용한다. 종종 예는 고체 지지체 ^11,12,13, 열, 스퍼터, 또는 거친 금속 필름 ^{(11, 12)의} 전기 화학적 증착, 다양한 화학 합성 방법 ^(13)에 단 분산 나노 입자의 고정화를 포함 해결. 이러한 기술은 비교적 간단하고 저렴한 경향이 있지만, 이들 중 대부분은 구조물의 위치 제어의 부족, 제한된 샘플 간 재현성 도전된다.

대조적으로, 하향식 리소그래피 기술은 표면에 원하는 패턴을 생성하기 위해 이러한 입자 빔으로서 조작 가능한기구를 채용한다. 가장 자주 사용 하나고체 지지체 ^{(11, 12)에} 다른 기판을 설계하는 것도 허용는 10 nm 이하로 내려가요 형상물 나노 리소그래피 방법은, 전자선 묘화 (EBL)는 최상의 제어를 제공한다. EBL에서 전자의 빔은 노출 된 지역에서 화학적 변화를 일으키는 전자 민감한 소재 (레지스트)의 표면에서 직경 검사에서 수 나노 미터의 자리까지 집중했다. 포지티브 톤 레지스트를 들어 같은 적당한 용매 (현상액)에서 용해성이 향상 선도 폴리 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA), 레지스트를 구성하는 고분자 쇄의 절단에 전자 빔 노출의 결과로서. 전자빔 리소그래피 공정은 기판 상에 레지스트의 균일 한 층의 스핀 – 코팅을 포함한다; 전자빔 진공 챔버 내의 타겟 레지스트 재료의 노출; 샘플의 개발은 가용성 영역을 제거합니다.

이러한 융합 실리카와 같은 금속 나노 구조 아래 유전체 지원은 B가표시 EEN 크게 인해 실리콘 ^{(14, 15)와} 같은 다른 재료에 비해 플라즈몬 파의 현지화 SERS의 강도를 증가시킵니다. 그러나 EBL 패터닝은 유전체 기판 상에, 특히 나노 스케일에서, 노광시 빌드 업 충전으로 인해 상당한 어려움을 수반한다. 이전에, 우리는 이러한 어려움이 레지스트 위의 도전성 고분자 층을 배치함으로써 극복 될 수 있다는 ^16,17 보여준다.도 2를 융합에 금속 나노 구조물을 생성하기 위해 금속 증착 및 리프트 오프이어서 EBL 노광 및 현상을 이용하여 전체 제조 공정의 개략도를 도시 실리카 지원합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

전자의 2. 계획도. 빔 리소그래피, 금속 증착 및 리프트 오프 공정 유전체 기판 ^16-19에 금속 나노 구조를 제조하는데 사용될 절차 lectron 본 논문에서는 EBL, 기판의 바이오 기능화하여 SERS 기판의 제조를 포함하는 프로세스 단계들의 전체 시퀀스를 제시하고, 라만 스펙트럼의 컬렉션입니다. 우리의 최근 작품 ^{(18, 19)에서} 탐구 세 가지 디자인 (참조 : 그림 3과 4, 표 1) 해결됩니다. 한 설계에있어서, 재조합 단백질이 융합 된 실리카 (FS) 지지체 ⁽¹⁸⁾ 상에 바이오 기능화 금 나노 구조물에 고정되고, 상기 단백질의 SERS 검출이 설명된다. 이 디자인에서, 재조합 포도당 – 결합 리간드 (D 글루코오스)와 ^{21,26,27없이 단백질은} 니켈 코팅에 FS의 Ag 나노 구조물 사이의 공간들 히스티딘 태그에 의해 고정화하고, 단백질에 결합 글루코오스 검출된다. 설계 3에서, 티올 화 도파민 결합 DN을앱 타머 ^{19, 23은} FS에 금 나노 구조에 고정하고, 고정 압 타머에 의해 도파민의 결합이 설명된다. 기판 라만 스펙트럼 취득 준비, 다른 생체 분자 고정화 전략의 대표적인에서 모든 관련 실험 단계 인 클루 시브,이 예는 SERS의 발전에 SERS에 의해 나노 생물 인터페이스를 심문 탐사 연구에서, 응용 프로그램의 광범위한 다양한 유용 인식 방법으로 결합 된 단백질 또는 압 타머 – 리간드를 사용하는 작은 분자의 바이오 센서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

immobiliza 방법, 다른 생체 분자를 사용하여 세 가지 대표적인 디자인 3. 체계도기, 및 기판 재료 : (A) 자기 조립 단분자막 DI 물 11 mercaptodecanoic 산 (SAM) (MUA)로 관능 귀금속 나노 도트 상에 고정화 된 단백질; (B) 귀금속 나노 도트 사이의 기판 표면 상에 고정화 D 글루코오스와 복합 히스티딘 태그 글루코오스 결합 단백질 (GBP); (C) 귀금속 나노 도트에 고정 도파민 (DBA) 완료 도파민 결합 앱 타머를 티올은 종료. 표 1에서 자세한 내용을 참조하십시오. 패널 (B)에 도시 디자인 2에 해당하는 리간드없이 샘플도 비교를 위해 제조 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4.세 설계에 사용 된 생체 분자 (A) 단백질; (B) 당 결합 단백질 D 및 글루코스; (C) DNA 앱 타머 및 도파민 바인딩 도파민. 의 단백질 삼차 구조 (a)와 (b)는 각각, 및 LINUXAMD64에 대한 VMD으로 그려 단백질 데이터 뱅크, PDB ID 1BDD ²⁰ 2HPH ^21, 버전 1.9.1 ^(22)에서 가져옵니다. (c)에 앱타 머가 이차 구조 ValFold ^24은 소프트웨어를 사용하여 시퀀스 ^{(23)으로부터} 예측 및 PseudoViewer 3.0 ²⁵ 그려진다. G, A, T, C는 구아닌, 아데닌, 티민, 시토신 뉴클레오티드에 해당하는 문자, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

	디자인 1 </TD>	디자인 2	디자인 3
생체 고분자	단백질	포도당 결합 단백질 (GBP)	도파민 결합 앱 타머 (DBA)
바인더	11 Mercaptoundecanoic 산 (MUA) 자기 조립 단분자막 (SAM)	히스티딘 태그	티올 링커
리간드	없음	D 글루코오스	도파민
해결	탈 (DI) 물	인산 칼륨 완충액	트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 (TRIS) 및 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 버퍼; 인산염 완충 식염수 (PBS)
기판	FS에 금 구조	니켈 코팅 FS에의 Ag 구조	FS에 금 구조
무늬 AR개	× 10 μm의 4 μm의	× 8 μm의 4 μm의	× 10 μm의 4 μm의
무늬	금 점, 50 nm의 피치	AG 점, 40 nm의 피치	금 육각형, 200 nm의 피치
		AG는 육각형, 200 nm의 피치	금 구조화 패드
		AG 구조화 패드
EBL 노출 선량	점 :	점 : 105 μC ^/ ㎠	육각형 : 180 μC ^/ ㎠
	배열 I 120 μC ^/ ㎠	육각형 : 170 μC ^/ ㎠
	배열 II 96 μC ^/ ㎠
	배열 III (72)μC ^/ ㎠
레이저 여기 파장	532 nm의	532 nm의	780 nm의

표 1. 나노 생물 시스템의 세 가지 디자인.

Protocol

1.면 준비 1cm로 × 1cm 이하 주사위를 용융 실리카 (FS) 웨이퍼를 절단하는 반도체 다이 싱 톱을 사용합니다. 피라 솔루션에 청소 샘플 (H 2 SO 4 : H 2 O 2, 3 : 1;주의 : 강한 산화제) 15 분 동안 목욕 (28)는, 다음 탈 이온수에 주사위를 씻어 질소 건조. 핫 플레이트상에서 샘플을 15 분 동안 180 ° C 올려 놓는다. RT에 핫 플레이트에서 제거한 후 샘플을 냉각. 디자인 1과 3의 경우, 2 단계로 진행합니다. 이 설계의 경우, Ni를 10 nm의 층을 전자빔 증착 실 및 코트 샘플을 놓는다. 전자빔 리소그래피를 사용하여 나노 패턴 PMMA 마스크 2. 제조 (EBL) 스핀 코팅 PMMA 저항과 기판 상에 도전 층. 개별적으로 척에 중심에 진공 척 및 장소 샘플 웨이퍼 스피너를 사용합니다. 장소폴리 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA)의 한 드롭이 초 램프 시간과 60 초 동안 3500 rpm에서 유리 피펫을 사용하여 스핀 샘플의 중앙에 레지스트. 3 ~ 5 분 동안 180 ° C에서 기판을 굽는다. 기판을 소성 한 후, RT까지 시료를 냉각. 기판을 냉각시키고 척 스피너로 복귀하여, 기판 상에 도전성 중합체의 강하를 확산. 2 초 램프 시간이 3,000 rpm에서 40 초 동안 기판을 스핀. 1 분 80 ° C에서 구워 샘플. 표준 절차 16,17,18,29에 따라 EBL 노출을 수행합니다. 제조업체의 지침을 사용하여, 가장 작은 빔 크기를 갖는 표 1에서 특징 량을 이용한 노광 디자인을 준비한다. 전자빔 리소그래피 챔버로 샘플을로드. EBL 자동 초점 시스템이없는 경우, 포커스 용 비드 가장자리로부터 떨어져 패턴이 노출되는 곳에서 멀리 작은 흠집을 사용ING. 제조업체의 지침을 사용하여, 필요한 포커싱 적절히 점수차 보정뿐만 아니라 기록 필드 정렬 및 노광 시료를 수행한다. 적절한 노출 프로필과 최고의 패턴 품질을 허용하기 위해 30 keV의 전자 빔 에너지와 노출 7.5 μm의 조리개를 사용합니다. 전도성 고분자를 제거하고 노출 된 샘플을 개발한다. 현상 제 혼합물로 전도성 고분자 및 제 비이커를 제거하기위한 탈 이온화 (DI) 물 비커를 준비 (IPA : H 2 O, 7 : 3), 및 RT에서 5 분 동안 교반한다. 린스 에이전트로 세 번째 비커에 이소프로판올 (고순도)를 준비합니다. 핀셋을 사용하여, 그 후, 도전성 중합체 필름을 제거 현상에 시료를 놓고 서서히 상하로 20 초간 핀셋을 이동 3 초 동안 물에 시료를 배치했다. 즉시 이소프로판올로 기판을 이송하고 10 초 이상 씻어 다음, 질소와 샘플을 건조. </ OL> 3. 귀금속 나노 구조 제작 샘플의 표면 상에 증착 될 금속 증발을 허용하기 위해 거꾸로 전자빔 증착기 시스템에 샘플을로드. 약 0.1 나노 미터 / 초의 속도로 설계 한 3 및 디자인 2 10 nm 두께의 Ag 층을위한 샘플에 10 nm 두께의 Au 층을 증착. 물과의 높이에 초음파 시스템을 채우고 아세톤 별도의 비커를 입력합니다. 비커의 바닥에 샘플 얼굴을 배치하고 샘플을 10 분 동안 흡수 할 수 있습니다. 비커를 들고, 수욕으로 배치하고 아세톤 높이 물의 높이를 일치시키고 초음파 시스템을 켤 수있다. 초음파는 최대 60 초 동안 발생 할 수 있습니다. 단계 3.1에 설명 된 것과 동일한 과정을 사용하여, FS (디자인 1, 3)와, 니켈 코팅 된 FS (설계 2) SUBSTR에 10 nm 두께의 금속 박막의 균일 증착에 의해 Ag로 금 패드 기판을 준비2 단계를 건너 뛰는 오버라이드. 기판 4. 바이오 기능화 디자인 한 샘플을 준비합니다 실온에서 에탄올 11 mercaptodecanoic 산 (MUA)의 1 mM의 솔루션을 준비합니다. 10 분 동안 초음파 처리. 48 시간 동안 MUA의 용액에 적절한 나노 구조의 기판을 담근다. RT에서 5 분 동안 에탄올로 세번 건조 샘플을 씻어. (3- (디메틸 아미노) 프로필) 카르 보디이 미드 (EDC) DI 물 – N – 에틸 N '의 75 mM의 솔루션을 준비합니다. DI 물에 N의 -hydroxysuccinimide (NHS)의 15 mM의 솔루션을 준비합니다. 기판 상에 금에 마이크로 피펫 예금에게 NHS 100 ㎕를 사용하여 즉시 같은 지역에 EDC 100 ㎕를 추가합니다. 자기 조립 단분자막의 MUA (SAM)를 활성화하기 위해 1 분 동안 품어. 단백질의 100 μL 드롭을 기판의 같은 지역에 용액 (47 μM)를 놓고 다중 구획 페트리 D에 5 ° C에서 24 시간 동안 샘플을 저장다른 구획의 DI 물 1 ml로 흉내와 밀폐 커버. 지속적으로 각 비커에 20 초 동안 별도의 비커에 샘플을 교반 탈 이온수에서 샘플을 3 회 씻어. 샘플은 세척 후 또는 린스 동안 건조하게하지 마십시오. 5 단계로 진행합니다. 디자인이 샘플을 준비합니다 인산 칼륨 완충액에서 글루코오스 결합 단백질 (GBP)의 0.9 mM의 용액 (K 2 HPO 4, 25 ㎜, 7.5의 pH)을 준비한다. 버퍼 D 글루코오스를 100mM 용액을 준비한다. 100mM의 D-글루코스 용액 30 μL 및 1 ml의 플라스틱 마이크로 튜브 용기 및 마이크로 피펫은 0.9mm GBP 용액 30 μl를 섞는다. 30 분 동안 품어. 입금 리간드 무 GBP 용액 및 마이크로 피펫 준비된 기판상의 리간드 결합 GBP 용액 각 20 μL. 밀폐 커버와 페트리 접시에서 24 시간 동안 5 ° C에서 샘플을 저장합니다. 샘플을 3 회 씻어실온에서 칼륨 인산염 완충 용액. 5 단계로 진행합니다. 디자인 3 샘플을 준비합니다 7.4의 최종 pH와 EDTA TRIS 완충액을 사용하여 1 μM의 농도로 도파민 앱 타머를 결합 (DBA) 용액을 희석. 분석 저울에 도파민 분말을 측정하고 5 분 동안 교반 구슬 인산염 완충 식염수 (PBS)에 혼합하여 5 μM 농도 도파민 솔루션을 준비합니다. 각각의 기판의 표면에 DBA 용액 20 μL 방울을 증착하고 샘플 페트리 접시 위에 커버와 RT에서 1 시간 방치. 샘플을 인산 칼륨 완충액에서 3 회 (K 2 HPO 4, 25 ㎜, 7.5의 pH)을 헹군다. 직립 청정실 등급의 상부에 샘플을 배치하는 기판의 전면에 필름을 유지하면서 후방 건조 와이프. 대조군으로 따로 샘플을 설정합니다. 도파민 솔루션 오의 5 μL 드롭 배치N 원하는 도파민 농도 나머지 샘플들에 PBS 완충액 기존 방울의 표면. 10 분 동안 샘플을 품어. 앱타 머가없는 금 패드 표면에 도파민 용액의 방울을 놓는다. 10 분 동안 품어. 인산 칼륨 완충액으로 3 회 헹군다 샘플. 5. 라만 분광학 레이저 노광에 의해 증발을 방지하기 위해 방수 실에 각각의 샘플을 놓습니다. 유리 슬라이드에 화학적으로 비활성 높은 진공 그리스, 장소 샘플을 플라스틱 주사기를 입력하고 샘플을 건드리지 않고 샘플을 둘러싼 그리스의 몇 mm를 분배. 버퍼 진공 그리스와 접촉되지 않도록하고 기판 및 커버 슬립 사이에 얇은 액체 계면을 만들어 시일을 형성하도록 아래로 부드럽게 눌러 기판의 상부에 현미경 커버 슬립을 놓고. 사용라만 현미경 광학 시스템은 레이저를 켜지 않고도 샘플링되는 금속 나노 패터닝 된 영역의 표면에 초점을 얻었다. 10X 배율의 목적으로 시료의 손상을 방지하기 위해 20 초 미만의 총 지속 기간 사이 2.4-3.1 mW의 레이저 강도와 라만 18,19 샘플링을 수행한다. 표 1에 나타낸 바와 같이. 여기 파장을 사용하여 디자인 1, 2 및 3에서 시료의 라만 스펙트럼을 획득 또한 단백질 A, GBP 및 D- 글루코스, 및 도파민 파우더 금속없이 유리 슬라이드를 이용하는 솔루션 제어 라만 스펙트럼을 취득 같은 나노 구조 비교를 위해 지원합니다.

Representative Results

용액에서 자유 단백질 및 금속 함유 기판을 사용하지 않고, 용액 또는 분말 형태의 자유 리간드, 주요 구성 요소에 대한 제어 라만 스펙트럼을 수집, 해석 목적뿐만 아니라 적절한 비교를 가능하게하는 것이 중요하다.도 5a는 전형적인 라만 선물 나노 구조의 기판이없는 유리 슬라이드에 DI 물에 무료 단백질에 대한 스펙트럼. 가장 높은 라만 강도 두 밴드는 2,931cm의 밴드는 -1과 1,091cm -1, 각각 CH 및 CS 결합을 포함하는 진동에 해당합니다. 563cm -1, 1,450cm -1, 1,653cm -1 2,426cm -1과 같은 저급 라만 강도와 다른 대역은, 진동 모드 18,32,33,34의 중첩에 기인 할 수있다. 세 가지 상이한 농도, 0.3, 0.9 및 1.3 mm의 완충액 자유 리간드 GPB위한 제어 라만 스펙트럼은,도 5b에 도시되어있다. t에서 그가 2,935cm에서 밴드 반면, 용매 (35) 광대역 약 3,400cm -1 대응도 -1 32,33.도 5C 있음 D 글루코오스에 대한 높은 파장 라만 스펙트럼을 나타낸다 단백질의 CH 결합과 관련된 진동을 나타내고 1, 6, 100, 200, 400 MM : 서로 다른 농도에 대한 완충 용액. 글루코오스의 농도가 증가 될 때, CH 결합 진동 밴드 2,890cm -1 2,960cm -1에서 발생한다. 모두 532 nm 내지 780 nm의 여기 파장으로 수득되는 결정형 도파민 제어 라만 스펙트럼은도 5d에 도시된다. 라만 스펙트럼의 대부분은 굽힘 및 분자 19,36의 CH 결합 뻗어 벤젠 고리에서 비롯됩니다. 주위에 3,000cm -1에서 밴드의 일부는 532 nm에서 관찰하지만 780 nm의 여기 파장된다. PLOAD / 52712 / 52712fig5.jpg "/> DI 물에서 단백질의 제어도 5 라만 스펙트럼은 532 nm의 여기 파장 (18) (A)에서 얻어진; 완충 용액에서의 리간드 – 결합 단백질 글루코스 프리의 라만 스펙트럼은 532 nm의 여기 파장 (B)에서 수득; 완충액 D 글루코오스 라만 스펙트럼은 532 nm의 여기 파장 (C)에서 얻어진; 도파민 분말의 스펙트럼은 532 nm 내지 780 nm의 여기 파장 19의 (D)에서 얻어진. 모든 스펙트럼은 일반적인 솔루션 라만 스펙트럼 나노 기판없이 유리 슬라이드 (A, B, C) 및 분체 (D)이다. (D), 다양한 분자 진동 라만 시프트 정권의 할당은 다른 곳에서 19 설명 된대로 일반 원자 및 분자 전자 구조 시스템 (GAMESS) 30 MacMolPlt (31) 소프트웨어를 사용하여 수행 하였다. 18 Americ에의 허가 재판 패널 ()진공 사회. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 단계 1-3에 기술 된 바와 같이, 표면에 고정화 된 생체 분자에 대한 SERS 스펙트럼을 얻기 위해서는, 용융 실리카 지지체에 금속 나노 구조물을 포함하는 기판은 제조된다. 제작 된 기판들의 질은 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용하여 감시된다. 표준 SEM 절차는 다른 16,17,18, 19 설명과 의정서에 포함되지 않습니다. (6) 대표 SEM의 금과의 Ag 나노 도트 및 구조 (패널 광고)와 같은 나노 육각형의 이미지뿐만 아니라 비 등을 보여줍니다 Ag로 -structured 금 패드 (각각 패널 E 및 F). 다음 단계는 생물학적 표 1에 세 가지 설계를 이용한 나노 구조 재료를 기판 상에, 그리고 그들의 SERS 스펙트럼 획득 고정화를 포함한다. O를 라만 촬상 동안 수성 환경을 유지하기 RDER, 각 샘플은 해당 용액에 배치되어도 7에 도시 된 바와 같이 얇은 유리 커버와 캡핑 밀봉 (표 1 참조). 도 6 주 사형 전자 현미경 (SEM) SERS 기판으로서 채용 10 nm 두께의 Au와 표면의 Ag 나노 구조의 이미지 (A, B)의 나노 도트 어레이; (C, D) 나노 육각형의 어레이; (E, F) 구조화 패드. 구조의 Ag (오른쪽)와 기판 (10)에 FS nm 두께의 Ni 피막을 사용하는 반면, 금 구조를 갖는 기판 (왼쪽), FS 지지체를 이용한다. 다른 16,17,18 바와 같이 이미지가 얻어졌다.페이지 "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 솔루션 바이오 기능화 된 샘플의 라만 이미징을위한 방수 실 7. 계획. 한 설계에있어서, 재조합 단백질이 DI 물 18 11 mercaptodecanoic 산 (MUA)의 자기 조립 단분자막로 관능 기판 상에 고정화된다. 이 디자인에서 기판은 50 nm의 피치와 용융 실리카에 가변 도트 사이의 거리 (도 6a 및도 8 참조)와 금 도트 배열의 세 가지를 포함한다. 단백질 고정화 공정은 기판 상에 SAM의 형성을 시작한다. SAM과 단백질 사이에 공유 결합을 얻기 위해서는, SAM에의 카르 복실 산 그룹은 N의 혼합물로 처리하여 아민 – 반응성 NHS 에스테르로 변환된다 </EM> 에틸 – N '- (3- (디메틸 아미노) 프로필) 카르 보디이 미드 (EDC) 용액 및 DI 물에 N의 -hydroxysuccinimide (NHS) 용액. 단백질 고정화 단백질 (37)의 리신 잔기에서 NHS 기의 변위에 의해 발생한다. 금 나노 구조물 상에 고정화 된 단백질과 디자인 1 촬상 샘플의 예는도 9에 도시된다. (참조도 9A는 다른 도트 사이의 갭 바이오 기능화 된 금 나노 도트의 세 가지 배열을 포함 할 샘플의 광학 현미경 이미지를 나타낸다 또한 3AA 및 8)도,도 9b는 이러한 배열을 통해 라만 스펙트럼 매핑을 보여줍니다. 그것은 가장 높은 라만 강도는 강도가 낮은 어레이 최광 도트 사이에 간극 어레이 III에 대해 얻어지는 반면, 도트 사이의 갭이 좁은 아르 I에 대해 발견되는 것을 알 수있다. 이것은 높은 전기 저런 의해 제조 플라즈몬 강한 결합 효과에 의해 설명 될 수있다점 사이의 좁은 공간에 LDS (18). 그림 9c는 배열 I과 II에서 얻은 강한 SERS 스펙트럼을 보여줍니다. 스펙트럼은도 5a에서 본 솔루션의 무료 단백질의 라만 모드에 근접 여러 밴드 (1,630cm -1, 1,964cm -1, 2,280cm -1, 2,577cm -1과 2,916cm -1) 나타낸다. 단백질에서 발견되는 다양한 채권의 진동에 기인 한이 밴드는 모두 고정 된 단백질에 비슷한 위치에 및 솔루션에 나타나거나 고정 할 때 약간 다소 높은 파수에 시프트 중 하나. 반면, 단백질없이 MUA SAM에 의해 기능화 유사한 나노 기판의 SERS 스펙트럼은 그 그림 9 확인, 완전히 다른 패턴 (18)을 보여 표면 고정화 단백질 A의 SERS 매핑을 나타냅니다 를 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전. 그림 디자인 한 18에서 사용 FS 기판에 금 나노 도트의 세 가지 배열 8. SEM 이미지.이 배열은 동일한 50 나노 미터 피치와 도트 사이의 간격의 폭이 다른 결과 약간 다른 점 반경을 가지고있다. 이것은 세 가지 배열 PMMA 마스크를 생성하기 위해 상이한 EBL 노출량을인가함으로써 달성된다 (표 1 참조). 보다 높은 노광 도즈는 금속 및 발사 후 큰 Au로 도트 크기를 허용 PMMA 마스크의 넓은 구멍을 초래한다. 18 미국 진공 학회의 허가 재판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 레 / ftp_upload / 52712 / 52712fig9.jpg "/> 디자인 1 내지 18에 기재 고정화 단백질의도 9 SERS 촬상. 용융 실리카 기판 상에 50 nm의 피치와 상이한 도트 사이의 갭의 Au 나노 점의 세 가지 배열을 포함하는 (A) 시료의 광학 현미경 이미지 (참고 도 6), 바이오 – 작용도 3a에 도시 된 바와 같이. (B) 시료의 라만 매핑. 점 배열 I과 II에서 (C) SERS 스펙트럼. 패널 (B)에서, 종축은 기판에 대한 거리, 횡축은 라만 시프트를 나타내고, 및 범례 바 라만 강도를 나타낸다. 세로 패널에서 패널의 라인 (B) 및 (C) 용액 및 무료 단백질의 기준 라만 밴드를 나타낸다 (*)를 점선 (C)의 배열 I. 라만 스펙트럼에서 SERS 밴드를 나타내는 532 nm의 여기를 얻을 수 있었다파장. 18 미국 진공 학회의 허가 재판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 이 디자인에서, 재조합 당 결합 단백질 (GBP) D-21 글루코스 (리간드) 착화는 인산 칼륨 완충액에 적절한 기질 상에 고정화된다. 고정화 된 리간드 무료 GBP와 샘플은 또한 비교를 위해 준비가되어 있습니다. 이러한 설계에서, 글루코스 – 결합 단백질은 귀금속 (6)에 잘 니켈에 결합하지만 히스티딘 태그를 이용하여 표면에 부착된다. 기판은 니켈 코팅 FS에 Ag로 배열 나노 도트, 나노 육각형, 비정형의 Ag 패드를 포함하기 때문에 (도 6b는,도 6d 및도 6f는 각각), 하나는 고정화 단백질 분자의 대부분이 사이의 갭에 위치 할 것으로 예상 할 수있다 니켈 코팅 AV가 어디 AG의 나노 구조ailable. 라만 스펙트럼을 얻어 고정화 글루코스없고 포도당 – 결합 GBP 각각도 10a 및도 10b에 도시된다. 이러한 모든 스펙트럼을 나타낸다 완충액 (35)에 대응하는 광대역 약 3,300cm -1. 비정형의 Ag 패드 얻은 스펙트럼은이 하나의 밴드를 포함하며 예상대로 고정화 된 단백질의 Ag 표면에서 발견되지 않았 음을 확인, 어떤 단백질 진동 모드를 표시하지 않습니다. 대조적으로, 스펙트럼 분석 물 (32, 33)를 나타내는 1,550cm -1 -1 2,900cm 주위의 Ag 나노 도트 및 나노 육각형 전시 대역 배열로 얻은. 특히, 광대역 주위 1,550cm -1, 아미드 II 밴드로 알려진 단백질 (33, 34)에 결합 진동을 펩타이드 때문이다. 고려 된 경우,이 대역은 기능 사이의 Ag 니켈 표면에 고정화 GBP에서 진동 모드의 중첩을 나타낸다나노 – 도트 또는 나노 – 육각형 함유 기판이 사용되는 경우의 한 귀금속 나노 구조체의 근방의 이러한 모드의 SERS 증강을 나타낸다. 이 대역은 결합 단백질 가능한 니켈 면체의 Ag 패드 부재 SERS 증강 (도 5B)과의 부재하에 용액 중의 단백질 매우 약하지만 잘 단백질 액세스 일부 니켈 표면에 나노 구조의 기판에 대해 두드러진다 바인딩. 그러나, 더 중요한 본 연구는 다른, 좁은 밴드 주위에 약 2,900cm -1 (32, 33)를 wibrations CH 결합에 기인 할 수있다. 포도당이없는 GBP의 스펙트럼은 2,933cm -1 나노 육각형 기판 (그림 10A)와 유사한 파장의 나노 도트 기판과 약한하지만 식별 할 수있는 밴드에서 뚜렷한 밴드를 보여줍니다. 포도당 무료 단백질의 경우 차별화 된, 포도당 바인딩 GBP의 SERS 스펙트럼은 Figu에 표시 (10B)의 전시를 2,850cm -1과 2,910cm -1, 채권 진동 체제를 CH에 대응하는 2 개의 밴드를 다시. 밴드는 물론 나노 육각형 기판상의 포도당 – 결합 GBP의 스펙트럼 두드러진다, 또한 나노 도트 기판 상 GBP의 스펙트럼에서 볼 수있다. 2,850cm에 대역 -1 다른 밴드 반면 (2,910cm에서 2,890cm 합리적으로 근접 -1 한 용액에 D-글루코스로부터의 제어 라만 스펙트럼이며, 따라서 이것은 단백질에 결합 글루코오스 기인 할 수있다 1) 단백질과 포도당 모두의 CH 결합의 진동 때문이다. 하나는 포도당이없는 포도당 결합 된 기판 고정화 GBP에서 SERS 서명의 차이를 결론 지을 수있는 것은이 지역에서 관찰하고, 단백질 결합 된 포도당의 CH 결합의 진동은 설명 디자인을 채용 검출 있습니다. 10.jpg "/> 리간드 – 무료 (A) 및 디자인 (2)에 세 가지 다른 기판에 고정. 스펙트럼은 780 nm의 여기 파장 얻었다 리간드 바인딩 (B) 당 결합 단백질. 그림 10. SERS 스펙트럼 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의. 설계 3에서는 티올 종단 (23)과 맞춤 도파민 결합 압 타머 (DBA)는 트리스 기판 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 (TRIS) 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 완충액에 고정화되고, 도파민이어서 고정화 앱 타머 (19)에 결합된다. 이 디자인의 기판은 FS (그림 6C)에 금 나노 육각형의 배열을 포함하고 있습니다. 비정형 금 패드 (도 6E)도 제어 목적으로 사용된다. 형광 DNA 본질적이므로 38, 780 nm의 여기 waveleng 일이 요인을 줄이기 위해 디자인 (3)에 사용된다. 도파민이 영역에서 상당한 라만 활성을 나타내고있는 반면,이 설계에서, 인식 소자 (앱 타머)는,도 11에서 고려 라만 시프트 영역 라만 활성되지 않는다. 고정화 타머없이 단지 도파민에 노출 된 샘플들로부터 신호가 더 얻어진 도파민 밴드 (19)를 도시 없기 때문에, 관측 된 SERS 대역은도 11. 앱타 머가 결합 된 도파민에서 발생한 것으로 전에 첨가 종료 후 금 나노 구조물에 고정화 앱 타머의 SERS 스펙트럼을 비교함으로써 도파민. 예상 한 바와 같이, 고정 된 도파민 무료 앱 타머 라만 밴드가 발생하지 않습니다. 대조적으로, 발음 라만 밴드 수는 도파민 – 결합 고정화 앱 타머에 대해 관찰된다. 그림 11에서 대부분의 밴드의 위치는 진폭의 차이이기는하지만, 결정 도파민에 가까운 있습니다. igure 11 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 52712 / 52712fig11.jpg "/> 의 리간드가없는 (보라색 라인)와 리간드 바인딩 (파란 선) 도파민 결합 디자인에 금 나노 육각 기판에 고정 압 타머 (3) 19. 레드 라인 도파민 분말의 제어 SERS 스펙트럼을 보여줍니다. 그림 11. SERS 스펙트럼 하세요 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

SERS는 많은 독특한 장점을 제공하는 바이오 감지 매우 강력한 기술로 인정 받고있다. 매우 높은 감도가 피검 ^9,10,11,35 극소량 검출 가능하게하는 반면, 분자 진동과 관계 선택적 SERS 스펙트럼에서 특정 분석 물의 "지문"을 식별 허용한다. 또한, SERS는 물에 상대적으로 둔감 비파괴 기술이다, 따라서 그것은 아주 잘 자연 수성 환경 ⁹ 생물학적 물질을 프로빙에 적합합니다. 제시된 결과는 이러한 이점뿐만 아니라, 상기 생체 검출의 매우 유연한 라벨없는 기술로서 강한 SERS의 잠재력을 보여 강조한다. 다른 기판 고정화 생체 분자의 단일 층을 사용하는 세 가지 설계에서, 라만 모드는 자신 특정 분석에 기인 할 수있는 검색되었습니다. 이들 생체 분자의 검출 OR 각각의 리간드, SERS 기판에 대한 지원과 같은 용융 실리카의 평면 표면을 사용하는 입증되었다, 전자의 표면에 생체 물질의 인터페이스 바이오 전자 아키텍처 신흥와 관련하여 다수의 애플리케이션을 약속, 현재의 전자 및 마이크로 유체 설정과 호환 디자인한다 및 전기 화학 장치 ^2,3. 중요하게는, 둘, 셋의 설계에서 SERS 검출 소자로서 인식, 포도당, 도파민, 각각 표면 고정화 단백질과 앱 타머를 이용한 단층의 작은 분자의 특이 적 결합에 대해 입증되었다.

그러나, 몇 가지 측면은 "온 – 칩"설정에서 효율적인 SERS 바이오 탐지를 달성하기 위해 처리되어야합니다. 첫째, 대부분의 생체 분자에 대한 일반적인 공지 도전 건식 ENVI 같은 비 자연 조건에 노출 된 경우 특히 열화 성향이며했었다는 강렬한 레이저 빛. 프로토콜 동안, 우리는 항상 라만 스펙트럼 취득에 샘플의 제조에서, 전체 실험 기간 동안 적절한 용액에 침지 바이오 샘플을 유지하는 작용 화의 중요성을 강조 하였다. 후자의 경우, 사용자 정의 방수 챔버는 레이저 노출 동안 액체의 증발을 피하기 위해 (도 7)를 설계하고있다. 시료의 손상을 방지하기 위해 프로토콜의 단계 5.3에 기재된 바와 같이 노광 및 레이저 강도의 지속 시간은 제한되어야한다.

SERS 검출의 결과가 채용 기판과 금속 나노 구조물, 특히 간 기능 분리의 형상에 민감 발견된다. 그것은도 8 및도 9에서, 다음과 같이 설계 한 샘플의 SERS 강도는 용융 실리카에의 Au 나노 도트 사이의 갭 폭에 크게 의존한다. 금 나노 도트 중 세 가지 배열 내가 테스트N이 디자인 (도 8), 최고 라만 강도의 Au 기능 사이 좁은 간극을 가지며, 따라서보다 효율적 전자계 향상을 제공 어레이 I, 달성된다. 그림 9에서 보듯, 10 ~ 20 nm 이하의 수준에서 간 기능 분리의 제어가 필요합니다. SERS 기판을 제조하는 EBL을 채택, 여기에 설명 된대로, 간 기능 격차의 폭을 제어하기 위해 특별히 효율적인 해상도를 제공합니다. 포지티브 톤 EBL으로 PMMA와 같은 레지스트, PMMA 마스크의 구멍의 크기는 단순히 노출 선량을 변경함으로써 변화 될 수있다. 리프트 오프를 제조 한 후이 금속 도트의 크기가 다른 결과, ^{18 도스} EBL 적절한 노출을 선택함으로써 원하는대로 도트 사이의 갭의 폭은 조정될 수있다.

다른 문제는 특정 바이오 감지 응용 프로그램에 대한 SERS 기판 형상의 최적화입니다. 개선 효과 나 비록간 기능 갭의 감소에 ncreases은 생물학적 분자의 크기가 상대적으로 큰 간격이 될 수 있는지에 대한 제한이 좁은 부과한다. 이 아닌 도트 자체 (도 3b 참조), 고정화 방법은 단백질이 효율적에만 귀금속 도트 사이의 표면에 결합되도록 설계 인 2의 결과로부터 분명하다. 이 그림 10에서 다음과 같이 구조화의 Ag 패드 SERS 스펙트럼 분석에서 어떤 밴드를 표시하지 않습니다. 패드는 매우 얇은 섬간 갭과 나노 결정 구조를 나타내고 있지만 이러한 갭은 단백질 분자를 수용하기에는 너무 좁다 (도 6F 참조). 또 다른 차원의 복잡도는 단백질 – 리간드 결합이 검출되어야 할 때 부가된다. 도 10에서, SERS CH 밴드 가설 GBP 입체 구조의 변화에 의해 설명 될 수없는 하나의 리간드에 결합 된 리간드보다 GBP에서 스펙트럼에서 더 뚜렷, ^{D-7, 27} 글루코스 ^둘의 결합 증가 라만 활성이보다 경질 인 구조의 결과에 따라. 하나는 두 나노 기질, 리간드가없는 단백질에서 CH 대역 리간드 – 결합 단백질로부터 단백질 및 글루코스 CH 밴드 모두 나노 육각형 더욱 현저 반면, 나노 도트 기판 수득 SERS 스펙트럼에서 강한 비교하면 기판. 두 요소가 이러한 차이가 발생할 것으로 예상된다),은 (Ag 사이의 공간의 가용성은 GBP 니켈 (Ni)에 결합 수있는 곳 갖추고 있으며 "핫스팟"의 라만 산란의 전자기 향상에 리간드 결합 리간드 무료 단백질의 감수성 이러한 기능 사이. 한편, 나노 도트 패턴은 단백질의 Ag 나노 도트를 기판 상에 글루코스가없는 GBP 관찰 더욱 현저 CH 피크를 설명 할 수있는 바인딩 용 NI 피막이 가능 비교적 큰 간 특징 영역을 제공한다. 한편, 그 불균일 때문에 struc진짜야 (그림 6D 참조)),은 (Ag 나노 육각형 나노 육각형 기판에 포도당 바인딩 GBP에서 강한 CH 진동 밴드의 결과로 나노 육각형 내에서의 Ag 섬 사이의 좁은 틈에 강한 전자기 향상을 표시하는 경향이있을 수 있습니다. 이러한 작용의 일부 세부 사항은 상기 검증을 필요로하며, 이러한 GBP 큰 단백질을 포함하는 복잡한 분석을위한 SERS 기판의 최적화는 아직 파이프 라인.

다른 구성 요소가없는 반면 단지 리간드 선택된 영역 라만 활성 일 때 분명히 인식 요소로서 고정화 된 생체 분자를 이용한 SERS 리간드 결합 검출이 용이하게된다. 이 앱타 머가 결합 된 도파민의 SERS 뚜렷한 밴드 얻어 디자인 (3) (도 11)의 경우이다. 앱 타머 도파민 쌍은 우수한 특이성을 나타내고 SERS 스펙트럼은 어떤 중요한 배경 신호없이 두드러진 밴드를 포함한다.

<p class="jove_content"> 라벨 수수료 SERS 기술의 미래를 미리 다른 표면 나노 구조 설계의 넓은 범위의 생체 분자 'SERS 신호 향상의 광범위한 테스트를 포함한다. 직접 쓰기 전자빔 리소그래피의 사용은, 여기에 제시된 샘플 준비 프로토콜과 결합, 크기, 모양, 간 기능 분리 제어의 뛰어난 수준의 다양한 나노 구조를 제조하는 결과의 비교 및 교차 유효성 검사를 얻을 촉진 것 다른 연구 그룹에 의해. SERS 기판이 방법 ^11,12,13 "아래에서 위로"대안을 사용 제조되는 경우는 폭 넓은 다양한 최적의 기판 설계의 신뢰성 확인을 향해 금속 나노 구조의 크기와 위치의 더 나은 제어를 허용, 재현성의 주요 문제를 해결하는 것 응용 프로그램. 이러한 기술은 확장 성이어서 나노 보완 나노 리소그래피 방법과 EBL 조합함으로써 개선 될 수있다나노 스케일 설계 향후 양산 향하여 임프린트 리소그래피 ¹⁹ EBL 가변 기법을 채용 최적화.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank: David Wishart, Valentyna Semenchenko, Mark McDermott, Michael Woodside, and Albert Cao for their help in developing and preparing the protein conjugates as well as the DNA aptamer; T. M. Fahim Amin, Mosa Sharmin Aktar, and Trevor Olsen for their assistance in the sample preparation, Jonathan Mane for his assistance in generating images of the molecular structures; and the funding sources including the National Research Council of Canada – National Institute for Nanotechnology (NRC-NINT), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), and the University of Alberta for supporting the work.

Materials

11-Mercaptoundecanoic acid (MUA)	Sigma Aldrich (www.sigmaalrich.com)	450561 ALDRICH	Used for surface functionalization in Design 1
Conductive polymer	Mitsubishi Rayon (www.mrc.co.jp)	aquaSAVE-57xs	A 70 nm thick layer is used as anti-charging coating for EBL exposures
D-glucose	Collaborator Lab.		Ligand in Design 2
Dopamine	Collaborator Lab.		Ligand in Design 3
Dopamine binding aptamer (DBA)	Integrated DNA Technologies Inc. (www.idtdna.com)	5'- /Thiol Modifier C6 S-S/ AAAAAAAAAA GTCTCTGTGT GCGCCAGAGA ACACTGGGGC AGATATGGGC CAGCACAGAA TGAGGCCC-3'	Biopolymer in Design 3
Fused silica wafers	Mark Optics www.markoptics.com
Glucose binding protein (GBP)	Collaborator Lab. (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi\|145579532)	PDB ID 2HPH	Biopolymer in Design 2
High vacuum grease	Dow Corning (www.dowcorning.com)		Used to seal water-proof chamber, step 5.1
Hydrogen Peroxide 30%, H₂O₂	J.T. Baker		Used for pirahna solution, step 1.2
N-ethyl-N'-(3-(dimethylamino) propyl) carbodiimide (EDC)	Sigma Aldrich www.sigmaaldrich.com	03450 FLUKA	Used for immobilization of biopolymer in Design 1
N-Hydroxysuccinimide (NHS)	Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com)	130672 ALDRICH	Used for immobilization of biopolymer in Design 1
Potassium phosphate buffer	Collaborator Lab.		Buffer used in Raman sampling
Phosphate buffered	Collaborator Lab.		Solvent in Design 3
saline (PBS)
Polymethylmethacrylate (PMMA) 950 A2	MicroChem (www.microchem.com)		A 90 nm thick layer is used as EBL positive tone resist
Recombinant protein A	Protein Mods Inc (www.proteinmods.com)	PDB ID 1BDD (www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1bdd)	Biopolymer in Design 1
Sulfuric acid 96%, H₂SO₄	J.T. Baker		Used for pirahna solution, step 1.2
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) buffer	Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com)	T9285 SIGMA	Buffer in Design 3
Dicing saw	Diamond Touch Technology Inc.		Used to cut FS wafer, step 1.1
	(17301 W Colfax Ave # 152, Golden, CO)
Electron beam evaporator	Kurt J. Lesker (www.lesker.com)		Used for Au and Ag evaporation
Electron beam evaporator	Johnsen Ultravac (JUV) (www.ultrahivac.com)	JuV E-gun	Used for Ni evaporation
Microscope cover slips (25 mm)	Fisher Scientific (www.fishersci.ca)	12-545-102	Used in water-proof chamber, step 5.1
Microscope slides (3×1 in.)	Fisher Scientific (www.fishersci.ca)		Used in water-proof chamber, step 5.1
Raith 150^TWO EBL exposure system	Raith Inc. (www.raith.com)	Raith 150^TWO system	Used for EBL exposures, step 2.2
Raman microscope	Thermo Scientific (www.thermoscientific.com)	Nicolet Almega XR	Used for Raman spectroscopy, step 5.3
Sonicator system	Branson (www.bransonic.com)		Used for liftoff and solutions mixing
Spinner	Brewer Spinner and Hotplate (www.brewerscience.com)	Cee 200X and Cee 1300X	Used to spin-coat PMMA and conductive polymer, step 2.1

References

Sapsford, K. E., Tyner, K. M., Dair, B. J., Deschamps, J. R., Medlintz, I. L. Analyzing Nanomaterial Bioconjugates: A Review of Current and Emerging Purification and Characterization Techniques. Anal. Chem. 83, 4453-4488 (2011).
Walcarius, A., Minteer, S. h. D., Wang, J., Yu, L., Merkoçi, A. Nanomaterials for Bio-Functionalized Electrodes: Recent Trends. J. Mater. Chem. B. 1, 4878-4908 (2013).
Kim, J., et al. Applications, Techniques, and Microfluidic Interfacing for Nanoscale Biosensing. Microfluid. Nanofluid. 7, 149-167 (2009).
Rassaei, L., Singh, P. S., Lemay, S. G. Lithography-Based Nanoelectrochemistry. Anal. Chem. 83, 3974-3980 (2011).
Wong, L. S., Khan, F., Micklefield, J. Selective Covalent Protein Immobilization: Strategies and Applications. Chem. Rev. 109, 4025-4053 (2009).
Ley, C., Holtmann, D., Mangold, K. -. M., Schrader, J. Immobilization of Histidine-Tagged Proteins on Electrodes. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 88, 539-551 (2011).
Kim, D., Herr, A. E. Protein Immobilization Techniques for Microfluidic Assays. Biomicrofluidics. 7, 041501 (2013).
Anker, J. N., Hall, W. P., Lyandres, O., Shah, N. C., Xhao, J., Van Duyne, R. P. Biosensing with Plasmonic Nanosensors. Nature Materials. 7, 442-453 (2008).
Bantz, K. C., et al. Recent Progress in SERS Biosensing. Phys.Chem. 13, 11551-11567 (2011).
Sharma, B., Frontiera, R. R., Henry, A. -. I., Ringe, E., Van Duyne, R. P. SERS: Materials, Applications, and the Future. Mater. Today. 15, 16-25 (2012).
Kleinman, S. L., Frontiera, R. R., Henry, A. -. I., Dieringer, J. A., Van Duyne, R. P. Creating, Characterizing, and Controlling Chemistry with SERS Hot Spots. Phys.Chem.Chem.Phys. 15, 21-36 (2013).
Fan, M., Andrade, F. S., Brolo, A. G. A Review on the Fabrication of Substrates for Surface Enhanced Raman Spectroscopy and their Applications in Analytical Chemistry. Anal. Chim. Acta. 693, 7-25 (2011).
Cao, Y., Li, D., Jiang, F., Yang, Y., Zh, H. Engineering Metal Nanostructure for SERS Application. J. Nanomater. 123812, 1-12 (2013).
Glembocki, O., Rendell, R., Alexson, D., Prokes, S., Fu, A., Mastro, M. Dielectric-Substrate-Induced Surface-Enhanced Raman Scattering. Phys. Rev. B. 80, 085416 (2009).
Merlen, A., et al. Surface Enhanced Spectroscopy with Gold Nanostructures on Silicon and Glass Substrates. Surf. Sci. 605, 1214-1218 (2011).
Muhammad, M., Buswell, S. C., Dew, S. K., Stepanova, M. Nanopatterning of PMMA on Insulating Surfaces with Various Anticharging Schemes Using 30 keV Electron Beam Lithography. J. Vac. Sci. Technol. B. 29, 06F304 (2011).
Peters, R., Fito, T., Gutierrez-Rivera, L., Dew, S. K., Stepanova, M. Study of Multilayer Systems in Electron Beam Lithography. J. Vac. Sci. Technol. B. 31, 06F407 (2013).
Gutierrez-Rivera, L., Peters, R., Dew, S., Stepanova, M. Application of EBL Fabricated Nanostrucutred Substrates for SERS Detection of Protein A in Aqueous Solution. J. Vac. Sci. Technol.B. 31, (2013).
Gutierrez-Rivera, L., Peters, R., Dew, S., Stepanova, M. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Protein-Ligand Binding Using D-glucose and Glucose Binding Protein on Nanostructured Plasmonic Substrates. , (2014).
Peters, R. . Fabrication and Testing of Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Substrates for the Detection of Biomolecules [MSc Thesis]. , (2014).
Gouda, H., Torigoe, H., Saito, A., Sato, M., Arata, Y., Shimada, I. Three-Dmensional Solution Structure of the B Domain of Staphylococcal Protein A: Comparisons of the Solution and Crystal Structures. 生物化学. 31, 9665-9672 (1992).
Cuneo, M. J., Johnson, S. J., Beese, L. S., Hellinga, H. W. High Resolution Structure of E. Coli Glucose/Galactose Binding Protein Bound with Glucose. Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) Protein Data Bank. , (2009).
Humphrey, W., Dalke, A., Schulten, K. VMD – Visual Molecular Dynamics. J. Molec. Graphics. 14, 33-38 (1996).
Walsh, R., DeRosa, M. C. Retention of Function in the DNA Homolog of the RNA Dopamine Aptamer. Biochem. Biophys. Res. Comm. 388, 732-735 (2009).
Akitomi, J., Kato, S., Yoshida, Y., Horii, K., Furuich, M., Waga, I. ValFold: Program for the Aptamer Truncation Process. Biomed. Inf. 7, 38-40 (2011).
Han, K., Lee, Y., Kim, W. PseudoViewer: Automatic Visualization of RNA Pseudoknots. Bioinformatics. 18, S321-S327 (2002).
Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic Binding Proteins: a Versatile Superfamily for Protein Engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14, 495-504 (2004).
Benson, D. E., Conrad, D. W. Design of Bioelectronic Interfaces by Exploiting Hinge-Bending Motions in Proteins. Science. 293, 1641-1644 (2001).
Bozic, S., Chorzempa, J. . Pirahna Cleaning. , (2011).
Mohammad, M. A. Raith 150TWO SOP. , (2011).
Schmidt, M. W., et al. General Atomic and Molecular Electronic Structure System. J. Comput. Chem. 14, 1347-1363 (1993).
Bode, B. M., Gordon, M. S. MacMolPlt: a Graphical User Interface for GAMESS. J. of Mol. Graph. Mod. 16, 133-138 (1998).
Bright, A., Devi, T. S. R., Gunasekaran, S. Spectroscopical Vibrational Band Assignment and Qualitative Analysis of Biomedical Compounds with Cardiovascular Activity. Int. J. Chem. Tech. Res. 2, 379-388 (2010).
Bandekar, J. Amide Modes and Protein Conformation. Biochim. Biophys. Acta. 1120, 123-243 (1992).
Barth, A., Zscherp, C. What Vibrations Tell About Proteins. Quarterly Reviews of Biophysics. 35, 369-340 (2002).
Chrimes, A. F., Khoshmanesh, K. h., Stoddart, P. R. M. i. t. c. h. e. l. l. A., Kalantar-Zadeh, K. Microfluidics and Raman Microscopy: Current Applications and Future Challenges. Chem. Soc. Rev. 42, 5880-5906 (2013).
Park, S. -. K., Lee, N. -. S., Lee, S. -. H. Vibrational Analysis of Dopamine Neutral Base based on Density Functional Force Field. Bull.-Korean Chem. Soc. 21, 959-968 (2000).
Briand, E., Salmain, M., Compère, C., Pradier, C. M. Immobilization of Protein A on SAMs for the elaboration of immunosensors. Coll. Surf. B: Biointerfaces. 53, 215-224 (2006).
Lakowicz, L. R., et al. Radiative decay engineering: 2. Effects of Silver Island Films on Fluorescence Intensity, Lifetimes, and Resonance Energy Transfer. Analytical biochemistry. 301, 261-277 (2002).

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Peters, R. F., Gutierrez-Rivera, L., Dew, S. K., Stepanova, M. Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Biomolecules Using EBL Fabricated Nanostructured Substrates. J. Vis. Exp. (97), e52712, doi:10.3791/52712 (2015).