Surface Enhanced Raman Spectroscopy Détection de biomolécules Utilisation EBL fabrication des substrats nanostructurés
Summary
We describe the fabrication and characterization of nano-biological systems interfacing nanostructured substrates with immobilized proteins and aptamers. The relevant experimental steps involving lithographic fabrication of nanostructured substrates, bio-functionalization, and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) characterization, are reported. SERS detection of surface-immobilized proteins, and probing of protein-ligand and aptamer-ligand binding is demonstrated.
Abstract
Fabrication et caractérisation des systèmes de nano-biologiques conjugués interfaçage nanostructures métalliques sur des supports solides avec des biomolécules immobilisées est signalé. La totalité de la séquence d'étapes expérimentales pertinentes est décrite, impliquant la fabrication de substrats nanostructurés en utilisant la lithographie par faisceau d'électrons, l'immobilisation de biomolécules sur les substrats, et leur caractérisation utilisant surface améliorée spectroscopie Raman (SERS). Trois modèles différents de systèmes de nano-biologiques sont employés, y compris la protéine A, la protéine de liaison de glucose, et un ADN aptamère de liaison de la dopamine. Dans les deux derniers cas, la liaison de ligands respectifs, le D-glucose et de la dopamine, est également inclus. Les trois types de biomolécules sont immobilisées sur des substrats nanostructurés par différentes méthodes et les résultats de l'imagerie sont présentés SERS. Les capacités de SERS de détecter les modes de vibration à partir de protéines de surface immobilisé, ainsi que pour capturer l'une protéine-ligandd aptamère-liaison du ligand est démontrée. Les résultats illustrent également l'influence de la géométrie de la surface de nanostructure, stratégie d'immobilisation de biomolécules, l'activité Raman des molécules et la présence ou l'absence de la liaison sur les spectres de SERS acquis ligand.
Introduction
Capacités pour développer et caractériser les systèmes de nano-biologiques conjugués interfaçage nanostructures solides et polymères biologiques sont de plus en plus important de nouvelles avancées dans la prochaine génération de bio-détection et de bio-technologies actionnement 1,2. Cela implique des études multidisciplinaires dans un certain nombre de domaines de recherche, tels que la fabrication de composants pertinents à l'état solide (micro ou nano-électrodes, revêtements nano-ingénierie, les nanofils ou nanoparticules) 2,3,4; immobilisation de biomolécules sur les surfaces à créer bioconjugués souhaités 5,6,7; et le suivi des interfaces nano-biologiques 1. Dans la plupart des cas, la sélection de la fabrication optimale, bio-fonctionnalisation, et les méthodes de caractérisation est fortement interdépendants. Il est clair que le choix des techniques de nanofabrication serait entraîné par les exigences des composants à l'état solide du système, étant en grande partie dépendante de la méthode de détection, dans lequel turn est déterminée par la nature des biopolymères qui participent et afin de contrôler l'interface.
Sur un large éventail de techniques appliquées pour caractériser les systèmes de bioconjugués 1,3, spectroscopie Raman de surface améliorée (SERS) a émergé comme une méthode très prometteuse pour la détection d'espèces chimiques et biologiques sur des surfaces 8,9,10,11. SERS emploie diffusion inélastique de la lumière monochromatique par les biomolécules à la surface immobilisé (figure 1) permettant la capture de signatures uniques correspondant à des vibrations moléculaires. Cette capacité de faire la distinction entre les différentes molécules étiquettes, sans faire intervenir la chimie complexe, ou des étapes fastidieuses, fait SERS une méthode potentiellement très efficace de la bio-détection. Un autre avantage important de la SERS est sa grande sensibilité. L'excitation de plasmons de surface localisés par la lumière interagissant avec nanostructures de métaux nobles (substrats SERS) augmente considérablement l'intensité de diffusion Raman par l'analyte, ce qui permet la détection de très petites quantités de molécules, de monocouches jusqu'à la limite seule molécule 8,9,10,11. Enfin, la plupart des biomolécules nécessitent des solutions aqueuses stables. Parce que l'eau a souvent l'activité Raman limitée, signal de fond à partir d'échantillons aqueux est minimisé neuf. Applications de la SERS ont affiché une augmentation exponentielle au cours de la dernière décennie 10. Cependant, un défi beaucoup discuté de la SERS est que l'amélioration électromagnétique de diffusion Raman dépend essentiellement de la taille, la forme, et l'espacement des nanostructures métalliques où les ondes plasmoniques sont induites 11,12,13. Pour atteindre SERS efficace et reproductible des mesures, un contrôle sur la géométrie du substrat est nécessaire aux dimensions nanométriques.
Figure 1. Schème de la spectroscopie Raman de surface améliorée.
De nombreuses méthodes employées pour fabriquer des substrats SERS 11,12,13 peuvent être grossièrement classés en bottom-up et top-down méthodes. Méthodes du premier type utilisent divers processus d'auto-assemblage ou la synthèse chimique dirigée pour produire des nanostructures. Souvent adressées exemples comprennent l'immobilisation de nanoparticules monodispersées sur des supports solides, 11,12,13 thermique, pulvérisation cathodique ou dépôt électrochimique de films métalliques rugueuses 11,12, et divers procédés de synthèse chimique 13. Bien que ces techniques ont tendance à être relativement simple et peu coûteux, la plupart d'entre eux sont mis au défi par un manque de contrôle sur l'emplacement des structures, et la reproductibilité limitée échantillon à échantillon.
En revanche, les techniques de lithographie top-down emploient instruments manipulables tels que des faisceaux de particules pour créer des motifs désirés sur surfaces. L'un des plus fréquemment utiliséméthodes de nanolithographie, la lithographie par faisceau d'électrons (EBL), offre de superbes contrôle sur les caractéristiques en dessous de 10 nm et aussi une flexibilité pour permettre différents modèles de substrat sur des supports solides 11,12. Dans EBL, un faisceau d'électrons concentré jusqu'à un endroit de quelques nanomètres de diamètre dans les analyses sur une surface d'un matériau sensible à électrons (résister) provoquant un changement chimique dans les régions exposées. Pour résiste à ton positif tel que le polyméthacrylate de méthyle (PMMA), électrons résultats d'exposition de faisceau de scission des chaînes polymères constituant le résist, ce qui conduit à une solubilité accrue dans un solvant approprié (développeur). Procédé de lithographie par faisceau d'électrons comprend de revêtement par centrifugation d'une couche uniforme de résist sur un substrat; l'exposition du matériau de réserve ciblée dans une chambre à vide avec un faisceau d'électrons; et le développement de l'échantillon pour éliminer les zones solubles.
Supports diélectriques en dessous de nanostructures métalliques, tels que de la silice fondue, ont been montré une augmentation significative de l'intensité en raison de la localisation SERS d'ondes plasmoniques par rapport à d'autres matériaux tels que le silicium 14,15. Cependant structuration EBL sur des substrats diélectriques, en particulier à l'échelle nanométrique, implique des défis importants en raison de facturer accumulation pendant l'exposition. Précédemment, nous avons montré 16,17 que ces difficultés peuvent être surmontées en plaçant des couches de polymère conducteur au-dessus de la résistance. La figure 2 montre un schéma de l'ensemble du processus de fabrication en utilisant l'exposition et le développement EBL suivie par le dépôt de métal et de décollage pour produire des nanostructures métalliques sur fusionné supports de silice. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Schéma de eLectron lithographie par faisceau, dépôt de métal, et le processus de décollage des étapes utilisées pour fabriquer des nanostructures métalliques sur des substrats diélectriques 16-19. Dans cet article, nous présentons la totalité de la séquence d'étapes de processus impliquant SERS substrats fabrication par EBL, bio-fonctionnalisation des substrats, et la collecte des spectres Raman. Trois modèles explorés dans nos œuvres récentes 18,19 sont abordés (voir figures 3 et 4, et tableau 1). Dans une conception, la protéine recombinante est immobilisée sur une bio-fonctionnalisées Au nanostructures sur une silice fondue (FS) support 18, et la détection de SERS de la protéine est mise en évidence. Dans ce modèle 2, recombinante la protéine de liaison glucose 21,26,27 avec et sans ligand (D-glucose) est immobilisé au moyen d'étiquettes d'histidine dans les espaces entre les nanostructures sur FS Ag Ni-revêtues, et la liaison du glucose à la protéine est détectée. In Design 3, thiolaté dopamine contraignant DNUn aptamère 19,23 est immobilisé sur Au nanostructures sur FS, et la liaison de la dopamine par aptamère immobilisé est démontrée. Inclusive de toutes les étapes expérimentales pertinentes de la préparation du substrat à l'acquisition de spectres Raman, et représentatifs des différentes biomolécules et les stratégies d'immobilisation, ces exemples sont utiles pour une large variété d'applications, de la recherche d'exploration interroger interfaces nano-biologiques par la SERS au développement de la SERS biocapteurs de petites molécules employant protéino ou la liaison comme une méthode de reconnaissance aptamère-ligand. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Schémas de trois modèles représentatifs utilisant différentes biomolécules, les méthodes de immobilization, et de substrat matériaux: (A) la protéine A immobilisée sur le métal noble nanopoints fonctionnalisés par une monocouche auto-assemblée (SAM) d'acide 11-mercaptodecanoic (MUA) dans de l'eau DI; (B) la protéine de liaison glucose marqué à l'histidine (GBP) complexé avec du D-glucose immobilisée sur la surface du substrat entre les métaux nobles des nano-points; (C) à terminaison thiol liaison dopamine aptamère complété par la dopamine (DBA) immobilisé sur métal noble nanopoints. Voir plus de détails dans le tableau 1. In Design 2 illustré par panneau (B), un échantillon sans le ligand correspondant a également été préparé pour la comparaison. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4.Biomolécules utilisées en trois modèles: (A) la protéine A; (B) la protéine de liaison du glucose et du D-glucose; (C) la liaison de l'aptamère ADN dopamine et la dopamine. Les protéines structures tertiaires en (a) et (b) sont tirées de Protein Data Bank, PDB ID 1BDD 20 et 2HPH 21, respectivement, et dessiné avec VMD pour LinuxAMD64, la version 1.9.1 22. La structure secondaire de l'aptamère en (c) est prédit à partir de la séquence 23 en utilisant le logiciel 24 ValFold et dessinée avec PseudoViewer 3,0 25. Les lettres G, A, T, C et correspondent à la guanine, l'adénine, la thymine, la cytosine et les nucléotides, respectivement. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Design 1 </td> | Design 2 | Design 3 | |
| Biopolymère | La protéine A | Protéine de liaison glucose (GBP) | aptamère de liaison de dopamine (DBA) |
| Liant | L'acide 11-mercaptoundécanoïque (MUA) monocouche auto-assemblée (SAM) | tags histidine | Linkers thiol |
| Ligand | Aucun | D-glucose | Dopamine |
| Solution | Déminéralisée (DI) | tampon phosphate de potassium | Tris (hydroxyméthyl) aminométhane (TRIS) et de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) tampon; Une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) |
| Substrat | Au structures sur FS | Structures Ag sur FS revêtement Ni | Au structures sur FS |
| Ar motifsea | 4 um x 10 um | 4 um x 8 um | 4 um x 10 um |
| Motif | Au points, 50 nm terrain | Ag points, 40 nm terrain | Au hexagones, terrain de 200 nm |
| Hexagones Ag, terrain de 200 nm | Au tampons non structurées | ||
| Ag tampons non structurées | |||
| Doses d'exposition EBL | Dots: | Dots: 105 uC / cm 2 | Hexagones: 180 uC / cm 2 |
| Tableau I 120 uC / cm 2 | Hexagones: 170 uC / cm 2 | ||
| Tableau II 96 uC / cm 2 | |||
| Tableau III 72uC / cm 2 | |||
| Laser onde d'excitation | 532 nm | 532 nm | 780 nm |
Tableau 1. Trois projets des systèmes de nano-biologiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
SERS gagne la reconnaissance comme une technique extrêmement puissante de la bio-détection offrant de nombreux avantages uniques. La relation avec les vibrations moléculaires permet d'identifier des «empreintes» de manière sélective d'analytes spécifiques des spectres de SERS, alors que la très grande sensibilité permet la détection de très faibles quantités de l'analyte 9,10,11,35. En outre, la SERS est une technique non destructive qui est aussi relativement insensible à l'eau, et donc il est très bien adapté pour sonder les matériaux biologiques dans leur environnement naturel 9 aqueuse. Les résultats présentés mettent l'accent sur ces avantages ainsi que montrent encore un fort potentiel de SERS comme une technique très souple sans étiquette de la bio-détection. Dans trois modèles différents utilisant des monocouches de biomolécules de substrat immobilisé, modes Raman ont été détectés qui pourrait être attribuée en toute confiance aux analytes particuliers. Que la détection de ces biomolécules, or leurs ligands respectifs, ont été démontrées en utilisant des surfaces planes de silice fondue comme support de substrats SERS, rend les modèles compatibles avec l'électronique et les réglages actuels microfluidique, promettant de nombreuses applications en relation avec les architectures bio-électroniques d'interfaçage matériaux biologiques avec des surfaces de électronique émergente et des dispositifs électrochimiques 2,3. Fait important, dans deux des trois conceptions de détection SERS a été démontrée pour la liaison spécifique de petites molécules, telles que le glucose et la dopamine, en utilisant des monocouches de la protéine de surface aptamère immobilisé et, respectivement, les éléments de reconnaissance.
Cependant, plusieurs aspects doivent être pris en charge dans le but de parvenir à un SERS bio-détection efficace dans le cadre "sur puce". Tout d'abord, une difficulté bien connue qui est commun à la plupart des biomolécules est leur tendance à se dégrader, en particulier lorsqu'il est exposé à des conditions non naturelles telles que envi secronnement ou de la lumière laser intense. Tout au long du protocole, nous avons souligné l'importance de toujours garder les échantillons bio-fonctionnalisé immergés dans des solutions appropriées au cours de l'ensemble de l'expérience, de la préparation des échantillons à l'acquisition de spectres Raman. Pour ces derniers, une chambre étanche à l'eau sur mesure a été conçu (figure 7) pour éviter l'évaporation du liquide au cours de l'exposition au laser. La durée de l'exposition et l'intensité du laser doit également être limitée comme décrit dans l'étape 5.3 du protocole pour éviter d'endommager les échantillons.
Les résultats de la détection de la SERS se trouvent sensible à la géométrie du substrat utilisé, et en particulier la séparation inter-élément des nanostructures métalliques. Comme il résulte des figures 8 et 9, l'intensité de la SERS une conception échantillons dépend fortement de la largeur des espaces entre des Au nano-points sur silice fondue. Sur trois tableaux de Au nanoplots testés in ce motif (figure 8), l'intensité Raman de la plus élevée est obtenue avec tableau I, qui présente les plus étroits espaces entre les éléments Au et il offre donc l'amélioration de champ électromagnétique plus efficace. Comme la figure 9 illustre, le contrôle de l'inter-longs séparations au niveau de 10-20 nm ou moins est nécessaire. Employant EBL pour la fabrication de substrats SERS, comme démontré ici, fournit une résolution efficace spécifiquement pour contrôler les largeurs des inter-longs lacunes. Avec une EBL-ton positif résister tel que le PMMA, la taille des trous dans les masques PMMA peut être modifiée en changeant simplement les doses d'exposition. Après le décollage cela se traduit dans différentes tailles de points métalliques, et la largeur des écarts entre les points peut être réglé comme souhaité en sélectionnant l'exposition EBL appropriée des doses 18.
L'autre défi est l'optimisation de la géométrie du substrat SERS pour l'application bio-détection spécifique. Bien que l'effet de l'amélioration increases avec une diminution des écarts inter-longs, la taille relativement importante de molécules biologiques impose des restrictions sur la façon de réduire les écarts peuvent être. Ceci est évident à partir des résultats pour la conception 2, où le procédé d'immobilisation est telle que la protéine se lie de manière efficace seulement à la surface entre les points de métal noble, mais pas pour les points eux-mêmes (voir la figure 3B). Comme il ressort de la figure 10, les spectres de SERS pour les plaquettes Ag non structurées ne montrent pas de bandes de l'analyte. Bien que les plaquettes présentent une structure nano-cristallin très minces écarts inter-îles (voir Figure 6F), ces lacunes sont trop étroites pour accueillir une molécule de protéine. Encore une autre dimension de complexité est ajoutée lorsque la protéine-ligand de liaison doit être détecté. Sur la figure 10, les bandes SERS CH sont plus prononcées dans les spectres de ligand lié GBP que dans le ligand une connexion, ce qui peut se expliquer par hypothèse un changement dans la conformation GBPlors de la liaison du D-glucose 2 7,27, résultant en une structure plus rigide avec une activité accrue Raman. Si l'on compare les deux substrats nanostructurés, la bande de CH de protéine libre ligand est plus forte dans les spectres de SERS obtenue avec le substrat nano-points, tandis que les deux bandes de protéines et le glucose CH de protéine de ligand lié sont plus prononcées avec les nano-hexagones substrat. Deux facteurs devraient se traduire dans ces différences, la disponibilité d'espace entre Ag dispose d'où le GBP pourrait se lier à Ni, et de la sensibilité de la protéine liée à un ligand et le ligand libre à l'amélioration électromagnétique de la diffusion Raman dans "points chauds" entre ces caractéristiques. D'une part, le modèle de nano-points offre une surface relativement plus grande inter-fonction où revêtement Ni est disponible pour la protéine de se lier, ce qui peut expliquer une bande de CH plus prononcée observée pour GBP sans glucose sur Ag nanopoints substrat. D'autre part, en raison de leur struc non uniformeture (voir Figure 6D), Ag nano-hexagones pourrait être enclin à montrer une amélioration électromagnétique forte dans les espaces étroits entre les îles Ag dans des nano-hexagones résultant de fortes bandes de vibration CH à partir du glucose lié GBP sur le substrat nano-hexagones. Certains détails de cette interaction exigent une vérification plus poussée, et l'optimisation des substrats SERS pour analytes complexes impliquant de grandes protéines telles que la livre sterling est encore dans le pipeline.
De toute évidence, la détection de la liaison en utilisant la SERS biomolécules immobilisées en tant qu'élément de reconnaissance ligand est facilité lorsque le ligand est seulement actif Raman dans une région sélectionnée, alors que les autres composants ne sont pas. Ce est le cas de la conception 3, où sont obtenus SERS prononcées bandes de dopamine aptamère lié (figure 11). La paire aptamère-dopamine présente une excellente spécificité et le spectre de SERS comprend des bandes marquées sans signal de fond important.
<p class="jove_content"> Avance avenir de la technologie de la SERS étiquette taxe impliquerait des tests approfondis de la SERS amélioration du signal de biomolécules avec une large gamme de modèles différents de nanostructures de surface. L'utilisation de écriture directe lithographie par faisceau d'électrons pour fabriquer divers nanostructures avec un superbe niveau de contrôle sur la taille, la forme et inter-fonction séparation, combinée avec les protocoles de préparation des échantillons présentés ici, serait de faciliter la comparaison et la validation croisée des résultats obtenus par différents groupes de recherche. Cela permettrait de répondre au défi majeur de reproductibilité lors SERS substrats sont fabriqués employant alternatif "bottom up" méthodes 11,12,13, permettant un meilleur contrôle de la taille et la position de nanostructure métallique vers une identification fiable de la conception de substrat optimale pour un large éventail de applications. L'évolutivité de ces techniques peut ensuite être améliorée par combinaison avec des méthodes de EBL nanolithographie complémentaires tels que nanolithographie par impression 19 vers le futur la production de masse de conceptions nanométriques optimisé en utilisant les techniques EBL accordables.Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank: David Wishart, Valentyna Semenchenko, Mark McDermott, Michael Woodside, and Albert Cao for their help in developing and preparing the protein conjugates as well as the DNA aptamer; T. M. Fahim Amin, Mosa Sharmin Aktar, and Trevor Olsen for their assistance in the sample preparation, Jonathan Mane for his assistance in generating images of the molecular structures; and the funding sources including the National Research Council of Canada – National Institute for Nanotechnology (NRC-NINT), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), and the University of Alberta for supporting the work.
Materials
| 11-Mercaptoundecanoic acid (MUA) | Sigma Aldrich (www.sigmaalrich.com) |
450561 ALDRICH | Used for surface functionalization in Design 1 |
| Conductive polymer | Mitsubishi Rayon (www.mrc.co.jp) |
aquaSAVE-57xs | A 70 nm thick layer is used as anti-charging coating for EBL exposures |
| D-glucose | Collaborator Lab. | Ligand in Design 2 | |
| Dopamine | Collaborator Lab. | Ligand in Design 3 | |
| Dopamine binding aptamer (DBA) | Integrated DNA Technologies Inc. (www.idtdna.com) |
5'- /Thiol Modifier C6 S-S/ AAAAAAAAAA GTCTCTGTGT GCGCCAGAGA ACACTGGGGC AGATATGGGC CAGCACAGAA TGAGGCCC-3' | Biopolymer in Design 3 |
| Fused silica wafers | Mark Optics www.markoptics.com |
||
| Glucose binding protein (GBP) | Collaborator Lab. (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi|145579532) |
PDB ID 2HPH | Biopolymer in Design 2 |
| High vacuum grease | Dow Corning (www.dowcorning.com) |
Used to seal water-proof chamber, step 5.1 | |
| Hydrogen Peroxide 30%, H2O2 | J.T. Baker | Used for pirahna solution, step 1.2 | |
| N-ethyl-N'-(3-(dimethylamino) propyl) carbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich www.sigmaaldrich.com |
03450 FLUKA | Used for immobilization of biopolymer in Design 1 |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com) |
130672 ALDRICH | Used for immobilization of biopolymer in Design 1 |
| Potassium phosphate buffer | Collaborator Lab. | Buffer used in Raman sampling | |
| Phosphate buffered | Collaborator Lab. | Solvent in Design 3 | |
| saline (PBS) | |||
| Polymethylmethacrylate (PMMA) 950 A2 | MicroChem (www.microchem.com) |
A 90 nm thick layer is used as EBL positive tone resist | |
| Recombinant protein A | Protein Mods Inc (www.proteinmods.com) |
PDB ID 1BDD (www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1bdd) |
Biopolymer in Design 1 |
| Sulfuric acid 96%, H2SO4 | J.T. Baker | Used for pirahna solution, step 1.2 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) buffer | Sigma Aldrich (www.sigmaaldrich.com) |
T9285 SIGMA | Buffer in Design 3 |
| Dicing saw | Diamond Touch Technology Inc. | Used to cut FS wafer, step 1.1 | |
| (17301 W Colfax Ave # 152, Golden, CO) | |||
| Electron beam evaporator | Kurt J. Lesker (www.lesker.com) |
Used for Au and Ag evaporation | |
| Electron beam evaporator | Johnsen Ultravac (JUV) (www.ultrahivac.com) |
JuV E-gun | Used for Ni evaporation |
| Microscope cover slips (25 mm) | Fisher Scientific (www.fishersci.ca) |
12-545-102 | Used in water-proof chamber, step 5.1 |
| Microscope slides (3×1 in.) | Fisher Scientific (www.fishersci.ca) |
Used in water-proof chamber, step 5.1 | |
| Raith 150TWO EBL exposure system | Raith Inc. (www.raith.com) |
Raith 150TWO system | Used for EBL exposures, step 2.2 |
| Raman microscope | Thermo Scientific (www.thermoscientific.com) |
Nicolet Almega XR | Used for Raman spectroscopy, step 5.3 |
| Sonicator system | Branson (www.bransonic.com) |
Used for liftoff and solutions mixing | |
| Spinner | Brewer Spinner and Hotplate (www.brewerscience.com) |
Cee 200X and Cee 1300X | Used to spin-coat PMMA and conductive polymer, step 2.1 |
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