表面增强拉曼光谱检测生物分子利用EBL装配纳米衬底

收集控制拉曼光谱的主要部件，包括游离的蛋白质在溶液中游离配位体在溶液或粉末形式的不使用含金属的基板，是很重要的，以使一适当的比较，以及用于解释的目的。 图5A呈现了典型的拉曼频谱在去离子水自由蛋白A上没有纳米结构基板用玻璃幻灯片。两个频带中的最高的拉曼强度，带在2931厘米-1和在1091厘米-1，对应于涉及CH和CS债券，分别振动。其它频带具有较低的拉曼强度如563厘米-1 1450 -1，1653厘米-1和2426厘米-1，可以归因于的振动模式18,32,33,34的叠加。控制拉曼光谱对配体游离GPB与三种不同浓度，0.3，0.9和1.3毫缓冲溶液，示于图5B。在T他图中，宽频带周围3400厘米-1对应于溶剂35中，而在带2935厘米-1表示涉及该蛋白质的CH键32,33。 图5C示出了高的波长的拉曼光谱为D-葡萄糖在振动1，6，100，200，和400毫：不同浓度的缓冲溶液中。当葡萄糖的浓度增加，CH键振动谱带出现在2890厘米-1和2960厘米-1。多巴胺在与两个532纳米和780纳米的激发波长获得的结晶形式的控制拉曼光谱示于图5D。大部分的拉曼光谱的来自苯环的弯曲和该分子19,36的CH键延伸。一些带中的约3000 -1仅在532纳米观察到，但尚未780nm的激发波长。 PLOAD / 52712 / 52712fig5.jpg“/> 蛋白A在DI水中图5.控制喇曼光谱获得在532nm的激发波长18（A）中 ;得到在532nm的激发波长（B）的配位体的无葡萄糖结合蛋白在缓冲溶液的拉曼光谱;得到在532nm的激发波长（C）的 D-葡萄糖中缓冲溶液的拉曼光谱;和在532纳米和780纳米的激发波长19（D）中获得的多巴胺粉末的光谱。所有的光谱是溶液的常规拉曼光谱（A，B，c）和粉末（D）在载玻片没有纳米结构的衬底。在（D），已完成使用通用原子和分子的电子结构系统（GAMESS）30和31 MacMolPlt软件作为其他19详细拉曼位移制度，以各种分子振动的分配。重印面板（a）在从18 AMERIC许可一个真空学会。 请点击此处查看该图的放大版本。 为了获得SERS光谱对于表面固定的生物分子，包括在熔融二氧化硅载体金属纳米结构基材如在步骤1-3中描述的制造。制成的基片的质量是利用扫描电子显微镜（SEM）进行监测。标准的SEM程序别处所述16,17,18，19和不包括在本协议中; 图6示出的Au和Ag纳米点和纳米六边形状结构板（镶板广告）的代表性SEM图像，以及非-structured金，银片（板E和F，分别）。下一步骤涉及生物材料上的纳米结构基材采用表1中所列的三种设计，并获得它们的SERS光谱的固定。邻的rDer维持期间拉曼成像水性环境中，每个样本被放置在其相应的溶液（ 见表1），盖有一个薄的玻璃盖，并密封， 如图7。 图6.扫描电子显微镜（SEM）的作为SERS基质10纳米厚的Au和Ag纳米结构表面的图像：（A，B）纳米点的阵列; （C，D）的纳米阵列的六角形; （E，F）非结构化垫。基板用Au结构（左）采用FS支撑，而用Ag结构（右）基板使用10nm厚的Ni涂层上的FS。如别处16,17,18记载的图像获得。PG“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。 图防水室中溶液的生物官能化的样品的拉曼成像7.方案。 在设计1，重组蛋白A固定在由11-mercaptodecanoic酸（MUA）在去离子水中18一个自组 ​​装单层官能基材。在该设计中，衬底包括凹点的三个阵列具有50纳米的间距和在熔融石英变间点的距离（参见图6A和图8）。蛋白质固定化的过程开始于一个的SAM的在基片上的形成。以获得共价的SAM和所述蛋白质之间的结合，自组装膜的羧酸基团被转化为胺反应性NHS-酯通过用氮的混合物</EM>乙基-N' – （3-（二甲基氨基）丙基）碳二亚胺（EDC）溶液并在去离子水中N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶液。 A蛋白固定发生的NHS组位移蛋白37赖氨酸残基。成像样品设计1用蛋白A固定化在Au纳米结构的一个例子示于图9。图9A给出了样品，其包含的生物官能化的Au纳米点具有不同的间隙点三个阵列的光学显微镜图像（见还图3AA和图8），和图9B显示了这些阵列喇曼频谱映射。它可以看出，在最高拉曼强度被发现为阵列I其中间点间隙最窄，而较低的强度被用于第三阵列与最宽的间隙点获得。这可以通过由较高电FIE产生更强的等离子体耦合效应来解释在点之间的狭窄的空间LDS 18。 图9C示出了用于阵列I和II中获得的最强SERS光谱。该光谱显示出几条带（1630厘米-1，1964厘米-1，2280厘米-1，2577厘米-1，2916厘米-1）在接近自由蛋白A的溶液中的拉曼模式见图5A。可归因于各种键在蛋白质中发现的振动，这些频段既出现在两个固定的蛋白质类似的地点和在溶液中，或者被稍微偏移到稍高的波数固定时。相比之下，类似的纳米衬底的SERS谱没有蛋白MUA SAM功能化表现出完全不同的图案18，确认图9代表的表面固定的蛋白质A的SERS映射请点击这里查看更大的版本这个数字。 图金纳米点的三个数组对FS基板设计1 18 8，使用SEM图像。该阵列具有相同的50纳米间距和略有不同的点半径产生不同宽度的跨点的差距。这是通过将不同的EBL曝光剂量以产生PMMA掩模三个阵列来实现（ 见表1）。较高的辐射剂量导致PMMA口罩更广泛的孔，允许金属化和升空后较大的凹点尺寸。转载来自18美国真空学会批准。 请点击此处查看该图的放大版本。 LES / ftp_upload / 52712 / 52712fig9.jpg“/> 衬底固定化蛋白A的设计1 18图9. SERS成像。（A）的样品的光学显微镜图像，由Au纳米点的三个阵列与石英玻璃基板50纳米节距和不同间点的间隙（也参见图6），生物官能化， 如图3A所示 。 （B）的样品的拉曼成像。 （C）SERS光谱从点阵列I和II。在面板（B）中 ，纵轴表示横跨基板的距离，横轴表示拉曼位移，和图例条表示拉曼强度。垂直虚线在板线（B）和（C）的代表游离蛋白A的溶液中，基准拉曼谱带（*）在面板（C）表示从阵列I中的拉曼光谱SERS谱带获得532 nm激发波长。转载来自18美国真空学会批准。 请点击此处查看该图的放大版本。 在设计2，重组葡萄糖结合蛋白（GBP）21复合与D-葡萄糖（配体）被固定在在磷酸钾缓冲液中的适当的基板。样品与固定的配体的无英镑用于比较还准备。在此设计中，葡萄糖结合蛋白附着由组氨酸标记，其结合良好，镍，但尚未到贵金属6的装置表面。由于在基片上包括镍涂覆的FS的Ag阵列纳米点，纳米六边形，和非结构化的Ag焊盘（ 图6B，6D和6F分别），可以预计最固定化蛋白质分子将位于之间的间隙银纳米结构，其中镍涂层AVailable。拉曼光谱得到的用于固定化的葡萄糖和无葡萄糖结合的GBP示于图分别如图10A和10B所示 ，。所有这些光谱显示出宽频带在大约3300厘米-1，这对应于缓冲溶液35。具有非结构化的Ag垫获得的光谱仅包含该单一频带，并且不显示任何蛋白质振动模式，确认固定化蛋白质被发现，但在银的表面如预期。与此相反，光谱获得具有银纳米点和纳米六边形展览频带周围1550厘米-1和2900厘米-1阵列，它代表了被分析物32,33。具体地，宽频带周围1550厘米-1，被称为酰胺Ⅱ带，是归因于肽键的蛋白质33,34的振动。在考虑的情况下，该带代表自GBP的振动模式固定在Ag特征之间的Ni表面的叠加s和指示这些模式中的贵金属纳米结构的附近的SERS增强使用含有纳米点或纳米六边形基底时。该频带是非常弱的用于在不存在SERS增强（ 图5B），以及不存在对Ag焊盘无镍表面可用于蛋白结合溶液中的蛋白，但它也明显为纳米基底与一些镍表面的蛋白质可访问绑定。然而，即使是对于本研究更重要的是其它，较窄的频带上大约2900厘米-1可以归因于CH键wibrations 32,33。葡萄糖-自由GBP的光谱显示在2933厘米-1与纳米点衬底，并在相似的波长与纳米六角形衬底（ 图10A）的弱，但可见的带显带。从葡萄糖游离蛋白的情况下显着，葡萄糖结合的GBP的SERS光谱示于Figu重新10B展示对应的CH键振动制度，在2850厘米-1和2910厘米-1两个频段。该频带是公宣判纳米六边形基底葡萄糖结合的GBP的频谱，并且它们还可以在英镑对纳米点衬底频谱可以看出。在2850厘米频带-1是相当接近的2890厘米-1 1在从D-葡萄糖溶液中的控制拉曼光谱，因此，可以归结为葡萄糖结合到蛋白，而其它频带（在2910厘米-1）是归属于CH键既蛋白质和葡萄糖的振动。人们可以得出结论，从葡萄糖和无葡萄糖结合的基板固定的GBP SERS签名的这种差异是可观察到的在该区域中，与CH键蛋白质结合的葡萄糖的振动是可检测的采用所描述的设计。 10.jpg“/> 图10. SERS的配体免费（A），并在设计2固定在三个不同的衬底的光谱与780纳米的激发波长获得的配体结合（B）葡萄糖结合蛋白 。 光谱 请点击此处查看大图这个数字。 在设计图3中，定制的多巴胺结合适体（DBA）与巯基终止23被固定在基底在三（羟甲基）氨基甲烷（TRIS）乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液上，并且多巴胺然后结合至固定化的适体19。衬底为这种设计包含金的纳米六边形上的FS（ 图6C）阵列。非结构化的Au焊盘（ 图6E）也被用于控制目的。由于DNA在本质上是荧光灯38，780 nm激发waveleng个被用于设计3，以减少这个因素。在此设计中，识别元件（适体）没有拉曼活性在图11中考虑的拉曼位移的区域中，而多巴胺示出在该区域一个显著拉曼活性。由于从暴露于仅多巴胺而不固定适体样本信号表明没有所得多巴胺频带19中，观察到SERS频带，预计从适体结合的多巴胺始发图11上金的纳米结构之前和添加之后比较固定的适体的SERS光谱多巴胺。正如预期的，固定化的多巴胺游离适体不表现出拉曼频带。与此相反，许多明显的拉曼频带的被观察到多巴胺结合固定化的适体。大多数频带的图11中的位置是接近那些在结晶多巴胺，尽管在振幅的差异。 igure 11“SRC =”/文件/ ftp_upload / 52712 / 52712fig11.jpg“/> 图11. SERS的配体-自由（紫色线）和配体结合（蓝线）多巴胺结合适体在设计固定在Au纳米六边形基底3 19。红线表示多巴胺粉末的控制SERS光谱。 光谱 请点击此处查看该图的放大版本。