最大等长收缩力的测量通过透骨骼肌纤维生成

所有涉及动物或人类受试者的程序应按照相关准则，法规和监管机构来执行。密歇根委员会对动物的使用和保养密歇根大学医学中心机构审查委员会的大学大学（UCUCA），并批准了所有的动物在本文中描述的人类手续。 1.解剖和存储解决方案股票注：在下面的指令中的最后一个卷可以放大或缩小的期望。 在一个1000毫升烧杯中，加800毫升去离子水（ASTM类型1）。保持温和搅拌，都在表1中列出的化合物添加到去离子水中，并允许他们溶解。 复合 期望中的浓。 （M）的 式重量（g / mol）的 加至1升（克） </ TR> K-丙酸 0.250 112.17 28.040 咪唑 0.040 68.08 2.720 EGTA 0.010 380.40 3.800 氯化镁2•6H 2 O 0.004 203.31 0.813 表1：解剖和存储原液组件。 带来至1000毫升去离子水的最终体积。注意，这是不必要至pH的溶液在这个时候。储存原液于4℃。 2.存储解决方案为了使将200ml的存储解决方案，开始用100毫升解剖和储存原液在250毫升烧杯中。添加足够的Na 2 H 2的ATP带来最终腺苷三磷酸（ATP）的浓度为2毫摩尔。带来至200毫升与甘油的最终体积。调节至pH 7.00与氢氧化钾（KOH）。储存在-20℃下贮存溶液。 注意：由于甘油的粘性性质，它可能难以准确地按体积分配。由于这个原因，我们一般按重量计添加甘油（100毫升的丙三醇的重量大约为126克）。 3.解剖解决方案使200毫升解剖溶液，开始用100毫升的解剖和储存原液在250毫升烧杯中。 添加足够的Na 2 H 2的ATP使最终ATP浓度为2毫摩尔。调节pH值至7.00用KOH。使终体积为200毫升去离子水。等分试样中以2.5ml体积并储存在-80℃。 4.进行剖析与解决方案58的Brij 注意：的Brij 58是一种非离子型洗涤剂是破坏（permeabilizes）脂质双层。 <OL> 使200毫升解剖用的Brij 58的溶液，开始用200毫升中的250毫升烧杯中的解剖溶液。保持温和搅拌，添加1克的Brij 58（0.5％重量/体积）的解剖溶液，并允许它以溶解。等分试样中以2.5ml体积并储存在-80℃。 5.测试解决方案注：以下是改编自Moisescu和Thieleczek 1978年（6）。见讨论有关准备测试解决方案的补充意见。 制备三个独立千毫升烧杯标记为“放松”，“预活化”和“激活”。加入400毫升去离子水到各烧杯中。 在表2所示的化合物添加到适当的烧杯中，然后加热该溶液至之间70℃和80℃。保持70-80℃的溶液温度下进行30分钟，同时连续搅拌。 注：70-80℃助攻的ELIMI温度碳酸的国家由碳酸钙用EGTA在活化溶液中的反应而形成的。放松溶液和预活化溶液处理以相同的方式作为活化溶液，以保持一致性。 RELAXING解决方案 PRE-活性溶液 活化溶液 复合式重量（g / mol）的所需浓度（mM） 必需的海量（G） 所需浓度（mM） 必需的海量（G） 所需浓度（mM） 必需的海量（G） HEPES（酸） 238.30 90.0 107.24 90.0 107.24 90.00 107.24 氧化镁 40.31 10.3 0.208 8.5 0.171 8.12 0.164 EGTA（酸） 380.40 52.0 9.890 52.00 9.890 HDTA（酸） 348.36 50.0 8.709 碳酸钙 100.10 50.00 2.503 表2：重新laxing，预活化和活化溶液组成。 冷却该溶液至室温，并添加足够的NaN 3 / KOH，使其终NaN 3的浓度为1mM。 注意：NaN 3（和叠氮化钠）是有毒的。请参阅之前处理这种化学物质的化学MSDS。 至100ml 100mM的叠氮化钠溶液中，添加0.65克的NaN 3至10ml的1N KOH。调整至100ml去离子水的最终体积。 将pH调节至约7.10使用的KOH。 以下步骤5.4添加足够的Na 2 H 2的ATP，使最终ATP浓度至8毫和足够的Na 2 CRP以使终肌酸phosophate（CRP）浓度至10mM。 带来每种溶液的使用去离子水500毫升最终体积。寒意或加热溶液到在该实验将执行的温度，然后用氢氧化钾使pH至7.10，同时保持该温度。 添加放松溶液至包含预活化溶液的烧杯，使得最终的预活化溶液为1份放松在500预活化溶液溶液。等分试样中以2.5ml体积并储存在-80℃。 6.进行缝合循环开始的非无菌的USP 10-0单线尼龙缝合线料。 使用镊子来创建与使用双上手结技术的链环。减少大小的结约750微米的直径。环直径可在显微镜下用目镜刻度标记进行评估。 使用microdissecting剪刀以除去多余的缝线只留下在任一侧的环和小的（500微米）的尾巴。的成品环的例子示于图1。 直到6.2-6.3可用4回路已重复步骤。商店循环在硅氧烷弹性体镀彼得我菜供将来使用。 注意：四缝合环所需要的每根纤维进行测试。 7.束样本注意：下面的步骤描述的过程解剖原始样本成更小的实验'捆'从其中单纤维将最终被提取和测试。在任何时候都应该样品小心对待。对于这个描述的目的，说明将给出如果研究者是右撇子。 获得的感兴趣的样品，并将其转移到设备，在夹层将发生。 注：组织活检的方法将根据实验模型和研究设计有所不同。在可能的情况，肌肉灌注应保持，直到活检时。 如果样品是收获站点和解剖部位之间传送，传送它在含有冷冻解剖溶液中，同时保持在冰上的小瓶。准备5cm的硅弹性体镀培养皿冷冻解剖溶液和两到三个昆虫安装管脚（直径100微米，不锈钢）。 样品转移到菜。确保样品仍浸没通过增加更多的解剖解决方案，如果有必要的。 检查在显微镜下的样品和操纵它对齐的纤维的纵向轴线朝向所述研究者（ 图2）的右肩。然后，通过钉扎在角锚定样品的菜。 注意：请使用任何剩余的结缔组织如在这个时候，因为这将最大限度地提高样品的使用和保护纤维的完整性锚固点。束可以固定在小的张力，以帮助限定纤维间边距。 与在左手镊子和在右边的microdissecting剪刀，开始沿纤维之间的纵向边缘轻轻解剖束注：根据其总长度，进一步剖析捆绑成无数个较小的包。 确保束尺寸测量约0.5-1毫米宽和≥3毫米长。 ，或者将一个统治者名下的菜评估使用在目镜刻度标记显微镜的尺寸。 取下并丢弃任何由镊子或销作为解剖过程的结果受损组织。 重复该过程，直到束的足够数量的被解剖或直到样品已经用完。 注意：可以得到将取决于很多因素，包括大小和初始样品的情况下，肌肉的形态，和研究者的技能束的数量。 8.纤维透转移从解剖溶液束到含有2.5新鲜，冷冻，用非离子型洗涤剂“的Brij 58'解剖溶液的小瓶中加入（0.5％，重量/体积）。在冰上孵育30分钟，偶尔，轻轻摇动。确保束保持整个孵化淹没。 在30分钟温育结束时，捆转移到含有新鲜解剖溶液（无的Brij 58）的小瓶中，并轻轻搅动，并简要以除去任何残留的洗涤剂。 9.准备捆绑的存储转移捆含冷藏存储解决方案小瓶和孵化一夜之间在4℃。 10.商店捆绑第二天，准备一个收纳盒，能够承受-80℃，有足够的个人0.5毫升旋盖锥形管，以适应在解剖过程中（每管一个捆绑）获得的所有包。每个锥形管应充满200-400微升新鲜的存储解决方案。 转移捆绑成单独标记锥形管。确保束不坚持锥形管或浮在溶液表面上的一侧。盖住锥形管和储存样品在-80℃直至测试日。 11.准备实验装置注：自定义装置由容纳长度控制器和力传感器，运动室系统和10X解剖显微镜的一个阶段。千分尺驱动装置允许精准操控的纤维附着表面。激光衍射图案被用于估计小节的长度。实验过程中所产生的数据被记录在个人计算机上。参考图3，对本实验的建立注释的图像。 每个解冻放松，预激活和激活解决方案之一小瓶和冰上维护。需要注意的是ATP和CRP是应保持在低温下不稳定的化合物。 准备显微镜，测试设备和相关联的计算机使用。 </li> 填写第一个试验室放松的解决方案。在我们的装置中，第一腔室含有棱镜允许研究者拍摄从侧光纤。填第二试验室具有预活化溶液和第三与活化溶液。 调节温度，以使在腔温度计显示读数15℃。螺纹两人准备缝合环上同时从力传感器和长度控制器（ 图5A）延伸的不锈钢连接表面。 12.提取透单纤解冻感兴趣的纤维束，并转移到有机硅弹性体镀培养皿中的新鲜，冰鲜轻松的解决方案。固定捆绑销在任一端，并确保它被浸没。 使用镊子，把握光纤在一端和顺利开始沿其纵轴提取它。 注：为压缩破坏引起的镊子纤维到底是不是在此时，因为在这方面的收缩特性不会测试一个关注的问题。护理应，但是，可以提取束的纤维时，由于纤维与细胞外基质之间的粘连会导致过度的张力，最终导致拉伸诱导的损伤采取。需要注意的是相当大的可变性存在于程度肌肉其中纤维粘附到周围的细胞外基质中。被怀疑已损坏由这样的拉伸的纤维应被丢弃。 用剃刀刀片或手术刀来修改一个吸管尖所示（ 图4）。光纤引入连同少量放松溶液的尖端。从硅氧烷弹性体镀培养皿的单纤维转移到试验室中，其中包含了轻松的溶液。 13.安装单纤维注：一步一步depicti上可以在图5中看到。 用镊子轻轻引导，从吸管尖取出​​纤维，并将其固定的长度控制器（左）使用第一缝合线环。 紧缩与镊子循环时使用一个单一的，平滑的运动。确保相等且相反的张力被施加到缝线的任一端。 第一环路应从长度控制器安装面的端部捆绑约1至2mm。 操纵朝向的力换能器的光纤的另一端（右），并使用相同的方法固定在纤维上。使用microdissecting剪刀（ 图5C）删除多余的缝线。 通过增加使用的x坐标微米驱动器（ 图3A）的长度控制器和力传感器臂之间的距离放置下少量张力的纤维。 螺纹的第二环在第一和锚定纤维在在0.2毫米的力换能器安装面（ 图5D）的端部的一个点。 使用microdissecting剪刀去除多余的缝线。 纤维附着过程可导致从腔室的溶液的损失。如果必要的话，加入更多的放松溶液以确保溶液的表面是平坦的（既不凹也不凸）。评估采用激光衍射小节的长度，当一个平坦的表面是非常重要的。 通过调整在y轴方向上的长度控制器的位置对齐平行于试验室的侧壁上的纤维。 使用棱镜侧视图勘测纤维和调整长度控制器在z轴的方向上的位置，直到该纤维是平行于腔室的地板上。 注：定位平行于腔室的地板上的纤维可以不室棱镜由第一聚焦在纤维和叔一端来实现母鸡，不调整显微镜聚焦，利用其z轴千分尺驱动使光纤的另一端成为焦点。 如果纤维是以任何方式扭曲，扭曲或损坏作为安装过程的结果，该纤维应当被丢弃，一个新的光纤连接的。 14.设置最佳小节的长度当纤维已在腔室中被正确地对准，插入校准目标屏幕到显微镜的前方面和对齐在第一实验室。 注意：目标屏是采用标准的光栅方程校准，λ= SLSINθ，其中SL是小节的长度，θ为0°和1°衍射光束和λ之间的衍射角是激光的波长。 打开激光器和调整，使得激光通过光纤的中心的舞台的位置。 注意：浓缩的激光光可以破坏牛逼Ø视力。不要试图通过显微镜以可视化的光纤时，激光器上。 相对于光纤定位到激光束衍射激光和观察的干涉图案的校准目标屏幕上（ 图6）。关灯更清晰地显现了这种模式。 注意：如果，用激光束的正确定位，没有干涉图案可以看到的，这表明，在纤维的肌原纤维组件是异常/损坏的，而且纤维应更换用新鲜。 要设置小节的长度，增加或减少有关使用长度控制器x轴千分尺驱动器，直至衍射光的期望间距目标屏幕上观察到的纤维的张力。 注：纤维的最佳小节的长度将依赖于动物的从其获得样品的物种。 2.7微米的肌节长度一般认为驴的时候是最佳唱从人体组织7,8的纤维。 后最佳小节的长度已定，测量两个最内缝线之间的距离。这是通过使用其控制腔室的x轴运动的微米驱动器上的数字读出最容易完成。定位腔，使得所述目镜的垂直横毛发上最里面的缝合线的最内边界对齐和置零微米驱动器上的数字读出。 平移沿x轴相对于所述显微镜的阶段，直到到达另一最内缝合。数字显示将指示所述光纤的长度。此值应记录为纤维长度L F。 注意：应该理解的是，这两个最内缝线之间的距离将决定收缩组织的功能长度被评估。研究者应当争取在一个在这方面的一致性（ 即 L F）一系列的实验。 15.估计截面面积（CSA）的保持光纤为 L f和使用显微镜载相机来同时从顶视图和侧视图捕获纤维的中央部分的高放大倍率的图像。侧视图的图片可使用嵌入在腔室的一侧的棱镜被捕获。 注意：当顶视图和侧视图之间移动来移动所述显微镜仅在y方向上，以确保这两个图像是“寄存器”，因此显示了纤维的同一部分的两个不同的观点是重要的。 获得的测量此时在研究后正常化的绝对力。该技术用于获得这些测量后述和在图7A和7B所示。 16.引导学生回答等长收缩注意：虽然这些实验过程中所产生的数据之间可以收集和解释，而无需使用一台计算机，软件，允许对力的响应的获取，显示，存储和分析是有利的。由我们实验室建立的定制LabVIEW软件允许这些功能，以及有能力设计'运动列车“支配的实验期间的长度控制器的动作。 确认放松，预活化的温度和激活溶液是稳定在15℃。 使用腔室控制软件对纤维移动到包含预活化溶液的腔室，并培育有3分钟。 注意：预活化溶液是弱缓冲以供的Ca 2+，导致引入光纤到活化溶液中时非常迅速激活和力的发展。 用10秒中剩余的预活化溶液，并保持为L f显示纤维长度，建立零FO在实验记录RCE水平。 注：长度控制器的“查找强制零'运动表明对应于零力的力换能器的水平（ 即纤维简要地变得松弛作为移动的结果）。被动力是零，并且力水平之前到换能器调零运动之间的差异。 在3分钟的末尾，将纤维以含有所述活化溶液的腔室，并允许最大等距力发展就证明了在力的高原是前面有一个快速上升。 达到最大等长收缩力后，使用长度控制器，以识别对应于零力在含有活化溶液腔室中的力换能器的输出。 注意：这是必要的，因为这对应于零力的力传感器的输出是，在一般情况下，对于每个溶液填充腔的不同。 继实现第二个力PLateau，返回该纤维含有该放松溶液的腔室。测试完成。任何一个会话期间吸测试多种纤维所有的解决方案，并添加新的，冷冻的解决方案。 注：以上的长时间引发宫缩最大布伦纳时的循环程序应予以考虑。此协议已被证明在最大限度活化纤维9保存结构和机械性能。