Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.
Invasion af omgivende normale væv anses generelt for at være et centralt kendetegn for ondartet (i modsætning til godartede) tumorer. For nogle kræftformer i særdeleshed (f.eks hjernetumorer såsom glioblastoma multiforme og pladecellecarcinom i hoved og hals -. SCCHN) er en årsag til alvorlig sygelighed og kan være livstruende, selv i fravær af fjerne metastaser. Desuden cancere, som har fået tilbagefald efter behandling desværre ofte til stede med en mere aggressiv fænotype. Derfor er der en mulighed for at målrette processen med invasion at tilvejebringe nye terapier som kan være komplementær til standard anti-proliferative midler. Indtil nu har denne strategi været hæmmet af manglen på robuste, reproducerbare assays er egnede til en detaljeret analyse af invasion og for narkotika screening. Her giver vi en simpel mikro-plade-metoden (baseret på uniform, selvsamlende 3D tumor kugler), som har et stort potentiale for en sådan studør. Vi eksemplificere assay platform ved hjælp af en human glioblastoma-cellelinie og også en SCCHN model, hvor udviklingen af resistens over for målrettede epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) hæmmere er forbundet med forøget matrix-invasiv potentiale. Vi tilbyder også to alternative metoder til halvautomatisk kvantificering: én ved hjælp af en imaging cytometer og en anden, som blot kræver standard mikroskopi og billedoptagelse med digital billedanalyse.
Klassisk udvikling anticancerlægemiddel er i vid udstrækning fokuseret på anvendelsen af in vitro celle-baserede assays til screening for cytotoksiske midler, der inhiberer tumor celleproliferation og / eller fremme programmeret celledød (apoptose). For nylig er indsatsen bevæget sig i retning målrettede terapier med udviklingen af inhibitorer af de underliggende molekylære årsager til malign celleproliferation. Til trods for nogle bemærkelsesværdige resultater, er sådanne midler ofte forbundet med den hurtige udvikling af lægemiddelresistens. Da det er den invasive og metastatiske potentiale af tumorceller, der er ansvarlig for hovedparten af kræftdødsfald, og at recidiverende sygdom ofte en mere aggressiv fænotype, er det logisk også at overveje yderligere in vitro eksperimentelle modeller 1,2 for at identificere hidtil ukendte agenter, der vil hæmme disse ekstra nøgle 'kendetegnende "af kræft.
Under malign progression erhverve tumorcellerevnen til at invadere omgivende væv og / eller spredning i fjerntliggende organer (metastase). Cancerceller trænger gennem basalmembranen ved dannelsen af invadopodia 3,4. Disse strukturer er beriget med actinfilamenter, specifikke adhæsionsproteiner og proteinaser og er kollektivt ansvarlige for tumorcellemotilitet og nedbrydning af den ekstracellulære matrix (ECM) 5. Invadopodia strække sig ind i ECM og menes at være vigtige for tumorcelleinvasion og også ekstravasation i vaskulære kanaler, lette hematogene (eller lymfe) udbredelse og metastase.
Aktuelle standardmetoder til vurdering tumorcelleinvasion in vitro omfatter følgende. Transwell-baserede eller Boyden kammer assays 2,6 hvor enkeltcelle-suspensioner podes på toppen af et filter belagt med et tykt lag af ECM-afledte proteiner. Celler derefter invadere og flytte ind i det nedre kammer som reaktion på en kemo-attraktant. Almindeligt anvendte ECMproteiner er type I collagen eller en basalmembran-lignende matrix (BMM, f.eks Matrigel, fra EHS tumor 7), som efterligner den naturlige sammensætning af basalmembraner.
Som et alternativ til de filterbaseret Boyden kammer assays 8 kan celler podes på toppen af et ECM-gel (som kan tilsættes fibroblaster), hvor de danner et monolag og derefter individuelt eller kollektivt invadere ind i gelen. Kan måles invasion i form af antallet af invaderende celler og / eller distance rejste fra gelen overflade 9. Tumorceller kan også helt indlejret i en matrix, enten som en enkelt celle suspension eller som sfæroider – sædvanligvis anbragt mellem to lag af gel-ECM tillader celler at invadere ud af tumormassen i det omgivende 2,6,10,11 matrix.
Den tredimensionale (3D) tumor klumpformet invasion assay beskrevet her tilvejebringer en hurtig, automatiserbar invasion under anvendelse af en highly reproducerbar og standardiseret metode 12 i en 96-brønds plade-format med en klumpformet per brønd. BMM tilsættes direkte til hver brønd for at give en halvfast matrice, hvori tumorceller invaderer fra klumpformet kroppen. Omfanget af tumorcelleinvasion overvåges med mellemrum over en periode på 72-96 timer. Denne fremgangsmåde tilvejebringer de følgende fordele i forhold til de nuværende in vitro invasion assays nævnt ovenfor: tumorcellerne er organiseret i en 3D-struktur efterligner en tumor mikro-region eller en mikro-metastase; tumor sfæroider er meget reproducerbar størrelse; invasionen assayet udføres in situ i den samme plade som tumor klumpformet udvikling, uden at det er nødvendigt at flytte dem til sekundære plader; fremgangsmåden, kombineret med de nyeste teknologier automatiseret billedanalyse, giver både høje indhold og high throughput analyser af tumorcelleinvasion.
Billedet analyse udføres under anvendelse af et billeddannende cytometer, som scanner en 96-brøndsplade inden for 10 min. Ved at bruge sammenløbet ansøgning, omfanget og hastigheden for invasion opnås enten ved enkelte celler eller ved celleklynger breder sig ud fra tumor sfæroider og invaderende ind i matrixen kan måles på en dynamisk måde. For lavere gennemløb, er en alternativ metode til billedanalyse præsenteret, baseret på brugen af et omvendt mikroskop og standard imaging software.
De to tumormodeller beskrevet her (glioblastoma og SCCHN) blev specifikt udvalgt til at eksemplificere vores 3D assay som de er klinisk relevante lokalt invasive cancere med et uopfyldt behov for effektive behandlinger 12. Efter lægemiddelbehandling, vurdering af in vitro farmakodynamiske (PD) biomarkør ændringer kan udføres nemt ved western blot eller immunoassays af lysater efter anvendelse af specifikke kommercielt tilgængelige reagenser for at tillade cellerestitueringen fra BMM og / eller immunofluorescens-analyse af invaderende tumor sfæroider ved hele mount farvning.
Denne invasion assay er en nyttig teknik til hurtig og reproducerbar bedømmelse af tumorcelleinvasion i et halvfast medium, og derfor særligt egnet til fremtidig in vitro drug screening. Kræftceller invadere matrixen i en 3D måde som de spredes ud fra et "mikro-tumor", repræsenteret ved tumoren klumpformet, og strækker sig ind i en extracellular matrix-lignende miljø. Den sande tredimensionalitet af assayet er tydelig i cellemorfologi, som er forskellig fra den flade, vedhængende morfologi celler antager, når de flytter på et fast substrat. Graden af invasion er let kvantificeres under anvendelse af enten et billeddannende cytometeret, giver en automatiseret udlæsning, eller ved anvendelse af en standard mikroskop i kombination med imaging software. Desuden er denne metode er egnet til fluorescerende billeddannelse 13 (for eksempel med cellelinjer, der udtrykker fluorescerende proteiner eller pre-mærket med fluorescerende farvestoffer).
Fremgangsmåden er enkel at udføre med den eneste kritiske trin repræsenteret ved tilsætning af BMM, når der er risiko for at forstyrre den centrale position af klumpformet i det U-formede godt. Dette kan resultere i suboptimal billedanalyse, med sfæroider i forskellige fokale planer. Det er derfor afgørende at tilføje BMM forsigtigt og langsomt til hver brønd. Efter BMM tilsætning er det tilrådeligt at tjekke pladenunder et mikroskop, og hvis lokalisering anses uacceptabel, kan dette afhjælpes ved forsigtig centrifugering. Med erfaring, det er sjældent nødvendigt. Mens denne metode er robust og meget reproducerbar, kunne inter-eksperimentel variation forekomme med forskellige batches af BMM. For at undgå dette, er det tilrådeligt at købe tilstrækkelig BMM fra en enkelt batch for at fuldføre en række undersøgelser.
En begrænsning af fremgangsmåden (som for sådanne assays) er vanskeligheden ved at skelne mellem invasion og proliferation, som tumorcellerne sandsynligvis undergår under analysen tidsramme. Selv om der kan tages fordoblingstiden af celler i betragtning, eller celle cyklus inhibitorer, såsom cytochalasin D indført, er det ikke let at kontrollere eller klar sondring mellem disse to forskellige aspekter af tumorprogression, især for hurtigt voksende tumorceller og for dem, have en mere "ekspansiv", snarere end infiltrativ, invasion mønster. Af denne grundforeslås det, at en parallel 3D vækst assay udført for at vurdere virkninger af eventuelle inhiberende eller stimulerende midler. Hvis omhyggelig dosis-respons undersøgelser udføres, kan det være muligt at vælge koncentrationer, der minimerer virkningerne på proliferation. For eksempel har vi vist, at HSP90 inhibitor 17-AAG inhiberer U-87 MG 3D tumor klumpformet invasion allerede ved 24 timer og ved koncentrationer under den koncentration, der hæmmer 3D vækst med 50% (GI 50) 12.
På den anden side, betydningen af dette assay sammenlignet med andre standard invasion assays (f.eks filter baseret assays eller invasion af enkelte celler i 3D matricer 1), er, at tumorceller invaderer ind i den omgivende matrix fra klumpformet, der ligner en " mikro-tumor "eller en" mikro-metastaser ", og derfor tager højde vigtige aspekter af patofysiologien af en tumor masse. Den metode, vi præsenterer giver oplysninger omkollektive adfærd af tumorceller, når oprindeligt forlader sfæroiderne, og også individuelt, når enkelte celler nå fjernere regioner i BMM. Derudover kan celler i tumor spheroids opleve hypoxi og næringsstoffer afsavn som gennem ændringer i genekspression, kan fremme migration og invasion; disse elementer er fraværende i 2D assays. Desuden alt dette er tilgængelig i en high-throughput format ved anvendelse af specifikke 96-brønds plader og den seneste imaging teknologi, hvilket tillader en mere kompleks 3D assay til nemt bruges i målvalidering og lægemiddelforskning.
Fremgangsmåden præsenterer vi kan rumme yderligere ansøgninger at behandle yderligere aspekter af tumorcelleinvasion. Især kan ekstra kompleksitet overvejes ved tilsætning af værtsceller, såsom fibroblaster og / eller endotelceller, i sfæroid selv eller den omgivende matrix. Dette kan også modificeres, ikke blot med hensyn til stivhed (ved anvendelse af forskellige concentrations af BMM), men også i form af sammensætning (ved tilsætning af andre komponenter er afhængige af specifikke væv / organ vedtagne tumor model: f.eks tenascin for hjerne kræft 16 og kollagen til brystcarcinom 17).
En lignende konfiguration (generering af sfæroider og billeddannelse) kan også tilpasses til at vurdere vævsinvasion i 3D, hvor tumor sfæroider dyrkes sammen med embryoide legemer ligner en kompleks væv 12 eller med andre cellespecifikke organoids (f.eks astrocytter til gliom 18 eller krypt kulturer til gastrointestinale kræftformer), men yderligere arbejde er påkrævet for at gøre det muligt for automatiseret billedanalyse.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Web address |
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | http://www.corning.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
Cultrex Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3432-005-01 | http://www.trevigen.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
Ultra-low attachment 96-well plate | Corning | 7007 | http://www.corning.com |
EGF | Miltenyi Biotec | 130-093-825 | http://www.miltenyibiotec.com Add 100 µl 1% BSA (w/v) in water to 100 µg EGF. To 25 µl of this, add 4,975 µl RHB-A medium to give a 10 µg/ml working stock. Aliquot and store at -20ºC |
RHB-A medium | Stem Cells Inc. | SCS-SF-NB-01 | http://www.stemcellsinc.com For diluting EGF |
DMEM | GIBCO | 31966-021 | http://www.lifetechnologies.com/ Warm in 37 °C waterbath before use |
Fetal Bovine Serum | Biosera | 1001/500 | http://www.biosera.com Heat at 56 °C to inactivate complement before use |
TrypLE | GIBCO | 12605 | http://www.lifetechnologies.com/ Cell dissociation solution |
Celigo cytometer | Nexcelom Bioscience | n/a | http://www.nexcelom.com Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative |
IX70 inverted microscope | Olympus | n/a | http://www.olympus.co.uk/ Used with camera for manual image capture |
Retiga Exi Fast 1394 digital camera | Qimaging | n/a | http://www.qimaging.com/ Attached to microscope for manual image capture |
Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Software used to control camera and microscope for manual image capture |
Image-Pro Analyzer 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size |
Excel 2010 | Microsoft | n/a | http://www.microsoft.com/ Scientific graphing and statistical software |
Prism 6.0 | GraphPad | n/a | http://www.graphpad.com/ Scientific graphing and statistical software |