Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.
周囲の正常組織の浸潤は、一般に、腫瘍(良性とは対照的に)、悪性の主要な特徴であると考えられています。特に、いくつかの癌( 例えば 、 多形性膠芽腫および頭頸部の扁平上皮癌などの脳腫瘍- SCCHN)のためには、深刻な罹患率の原因であり、生命を脅かすでも遠隔転移の不存在下であることができます。また、再発した癌は、残念ながら、多くの場合、現在より攻撃的な表現型での処理を以下に示します。したがって、標準的な抗増殖剤に対して相補的であり得る新規治療法を提供するために、侵入のプロセスを標的とする機会があります。今まで、この戦略は、侵入の詳細な分析および薬物スクリーニングに適した強固な、再現可能なアッセイの欠如によって妨げられてきました。ここでは、単純なマイクロプレート法を提供する(均一に基づいて、自己組織化3D腫瘍スフェロイド)のようなSTUのための大きな可能性を秘めています死にます。我々はまた、ヒト神経膠芽腫細胞株とターゲットと上皮成長因子受容体(EGFR)阻害剤に対する耐性の発達を強化マトリックス浸潤能と関連しているSCCHNモデルを使用してアッセイプラットフォームを例示します。単にデジタル画像解析を標準顕微鏡および画像キャプチャを必要とするイメージングサイトメーターおよび秒を使用して、1:我々はまた、半自動定量の二つの代替方法を提供します。
古典的な抗癌剤の開発は、腫瘍細胞の増殖を阻害し、かつ/またはプログラムされた細胞死(アポトーシス)を促進する細胞毒性薬をスクリーニングするためのインビトロ細胞ベースアッセイの使用に大きく集中しています。より最近では、努力は、悪性細胞増殖の基礎となる分子原因の阻害剤の開発と標的療法に向かって移動しています。いくつかの見事な結果にもかかわらず、そのような薬剤は、多くの場合、薬剤耐性の急速な発達と関連しています。これは、癌死亡の大部分の原因である腫瘍細胞の浸潤性および転移能であり、その再発性疾患はしばしばより攻撃的な表現型を示すことを考えると、それは、新規に同定するために、インビトロ実験モデルにおいて 1,2相補考慮することも論理的です癌のこれらの追加キー「顕著な特徴」を阻害する薬剤。
悪性進行の間に、腫瘍細胞は、取得します周囲の組織に侵入および/または遠隔臓器(転移)に拡散する能力。癌細胞は浸潤突起3,4を形成することにより基底膜を貫通します。これらの構造は、アクチンフィラメント、特定の接着タンパク質およびプロテイナーゼで富化一括腫瘍細胞の運動性及び細胞外マトリックス(ECM)5の分解に関与しているされています。浸潤突起は、ECMに延び、腫瘍細胞の浸潤のために重要であり、また、血行性(またはリンパ)播種および転移を促進する、脈管に溢出すると考えられています。
インビトロでの腫瘍細胞の浸潤を評価するための現在の標準的な方法は、以下のものが挙げられます。トランスウェルベースまたはボイデンチャンバーアッセイ単一細胞懸濁液は、ECM由来タンパク質の厚い層で被覆されたフィルタの上に播種した2,6。次いで、細胞を侵入し、化学誘引物質に反応して、下部チャンバーに移動します。一般的に使用されるECMタンパク質は、I型コラーゲン、または基底膜の天然の組成を模倣する基底膜様マトリックス(EHS腫瘍7から派生BMM、 例えば 、マトリゲル、)です。
フィルタベースのボイデンチャンバー型アッセイ8の代わりに、細胞は、それらがゲルに侵入個別にまたは集合的に、次に単層を形成し、(線維芽細胞を添加してもよいた)ECMゲルの上に播種することができます。浸潤は、ゲル表面9から走行浸潤細胞および/ または距離の数の点で測定することができます。通常、細胞は、周囲のマトリックス2,6,10,11に腫瘍塊から侵入することを可能にするECMのゲル状の2つの層の間に配置された-腫瘍細胞はまた、完全にマトリックス中にいずれかの単一細胞懸濁液として、またはスフェロイドとして埋め込 むことができます。
ここで説明した3次元(3D)腫瘍スフェロイド浸潤アッセイはhighlを使用して迅速、自動化侵入システムを提供しますウェルあたり1スフェロイドと、96ウェルプレートフォーマットでY再現性、標準化された方法12。 BMMは、腫瘍細胞が、スフェロイド本体から侵入先の半固体マトリックスを提供するために、各ウェルに直接添加されます。 96時間 – 腫瘍細胞浸潤の程度は、72の期間にわたって間隔でモニターされます。この方法は、上記のインビトロ浸潤アッセイで過電流、次のような利点を提供します:腫瘍細胞は、腫瘍の微小領域またはミクロ転移を模倣3D構造に編成されています。腫瘍スフェロイドのサイズは非常に再現性があります。浸潤アッセイは、二次プレートに移動する必要なく、腫瘍スフェロイド開発同じプレート中でその場で行われます。自動画像解析の最新技術と組み合わせる方法は、高含有量と腫瘍細胞の浸潤のハイスループット分析の両方を可能にします。
画像分析は、96ウェルをスキャンイメージングサイトメーターを用いて行われます10分以内にプレート。合流アプリケーションを使用することにより、浸潤の程度および速度は、単一の細胞によって、または細胞クラスターは、腫瘍スフェロイドから拡散及びマトリックスに侵入するのいずれかによって達成動的に測定することができます。低いスループットのために、画像解析のための別の方法は、倒立顕微鏡と標準画像化ソフトウェアの使用に基づいて、提示されます。
(神経膠芽腫とSCCHN)ここで説明する2つの腫瘍モデルは、具体的には、それらが効果的な治療法12に対する満たされていない必要性と臨床的に関連する局所浸潤癌であるように私たちの3Dアッセイを例示するために選択しました。薬物治療、 インビトロ薬力学(PD)バイオマーカーの変化の評価BMMおよび/ または全体によって腫瘍球の侵入の免疫蛍光分析からの細胞回復を可能にする具体的な市販の試薬 を使用し、次のウェスタンブロットまたは溶解物の免疫アッセイによって容易に行うことができ、次の染色をマウントします。
この浸潤アッセイは、in vitro薬物スクリーニングでの将来のための半固形培地ので、特に適切なへの腫瘍細胞の浸潤の迅速かつ再現性の評価に有用な技術です。癌細胞は、それらが腫瘍スフェロイドで示される「マイクロ腫瘍」から広がるように、3Dのようにマトリックスに侵入し、extracellul内に延びますARマトリックスのような環境。アッセイの真の三次元性が平坦とは異なる細胞形態に明らかである固体基板上に移動させるとき、付着形態の細胞が前提としています。侵入の程度は容易に、または画像化ソフトウェアと組み合わせて、標準的な顕微鏡を用いて、自動読み出しを可能にする、イメージングサイトメーターのいずれかを使用して定量します。さらに、この方法は、(細胞株は、蛍光タンパク質を発現するか、蛍光色素で予め標識付き例えば)13蛍光イメージングに適しています。
U字型のウェル内に回転楕円体の中心位置を乱す恐れがある場合の方法は、BMMの添加によって表されるだけの重要なステップで実行するのは簡単です。これは、異なる焦点面におけるスフェロイドと、次善の画像解析をもたらすことができます。これは、各ウェルに慎重にゆっくりとBMMを追加することが重要です。 BMMの添加後に、プレートをチェックすることをお勧めします顕微鏡下およびローカリゼーションが許容できないとみなされた場合、これは穏やかな遠心分離によって改善することができます。経験では、これはほとんど必要ありません。この方法は、堅牢かつ非常に再現性であるが、実験間の変動は、BMMの異なるバッチで発生する可能性があります。これを回避するために、一連の研究を完了するために、単一バッチから十分BMMを購入することが望ましいです。
(そのようなアッセイのためのような)方法の限界は、腫瘍細胞は、おそらく、アッセイの時間枠の間に受ける浸潤および増殖を区別するのが困難です。細胞の倍加時間を考慮し、またはそのようなサイトカラシンDなどの細胞周期阻害剤を導入することができるが、制御または明らかに、特に急速に成長する腫瘍細胞を、それらのために、腫瘍進行のこれらの二つの異なる側面を区別することは容易ではないことより「広大」のではなく、浸潤、侵入パターンを持っています。このためにそれは並列3D増殖アッセイは、任意の阻害または刺激剤の具体的な効果を評価するために実行されることが示唆されます。注意深い用量応答研究が行われている場合、それは、増殖に対する影響を最小限の濃度を選択することも可能です。例えば、我々はHSP90は17-AAGは、24時間で、50%(GI 50)12によって3Dの成長を阻害する濃度以下の濃度ですでにU-87 MG 3D腫瘍スフェロイドの浸潤を阻害する阻害することを示しました。
一方、このアッセイの重要性は、他の標準的な浸潤アッセイ( 例えば 、フィルタに基づくアッセイまたは3Dマトリックス1中に単一の細胞の浸潤)と比較して、腫瘍細胞が似ている、回転楕円体から周囲のマトリックスに侵入することです"したがって、マイクロ腫瘍」または「マイクロ転移」、とは、アカウントに腫瘤の病態生理学の重要な側面を取ります。我々は、本発明の方法は、情報を提供します最初にスフェロイドを残し、また、個々に、単一細胞をBMMにより遠い領域に達すると、腫瘍細胞の集団行動。さらに、腫瘍球内の細胞は、遺伝子発現の変化を介して、移動および浸潤を促進することができ、低酸素および栄養枯渇が発生する可能性があり、このような特徴は、2Dのアッセイには存在しません。また、これのすべては、より複雑な3D分析が容易に標的検証および創薬に使用することができるように、具体的な96ウェルプレートを使用することにより、高スループットフォーマットと最新の画像技術で利用可能です。
我々は、本発明の方法は、腫瘍細胞の浸潤のさらなる側面に対処するためのさらなるアプリケーションを収容することができます。具体的には、余分な複雑さは、回転楕円体自体または周囲のマトリックスの中に、例えば、線維芽細胞および/または内皮細胞のような宿主細胞の添加によって想定され得ます。これはまた、異なる同時の使用により(剛性の観点からだけではなく、変更することができますBMMのncentrations)だけでなく、組成の点で(採用腫瘍モデルの特定の組織/器官に依存して、他の成分を添加することにより:乳癌17)のための脳の癌16とコラーゲン例えば、テネイシン。
同様のセットアップ(スフェロイド及びイメージングの発生)は、腫瘍スフェロイドは、複雑な組織12または他の細胞特異的オルガノイド( 例えばためのアストロサイトとに似た胚様体と共培養され、3D、組織浸潤を評価するために適合させることができます神経膠腫消化管癌の18または陰窩の文化)が、さらなる作業が自動化された画像解析を有効にする必要があります。
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Web address |
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | http://www.corning.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
Cultrex Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3432-005-01 | http://www.trevigen.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
Ultra-low attachment 96-well plate | Corning | 7007 | http://www.corning.com |
EGF | Miltenyi Biotec | 130-093-825 | http://www.miltenyibiotec.com Add 100 µl 1% BSA (w/v) in water to 100 µg EGF. To 25 µl of this, add 4,975 µl RHB-A medium to give a 10 µg/ml working stock. Aliquot and store at -20ºC |
RHB-A medium | Stem Cells Inc. | SCS-SF-NB-01 | http://www.stemcellsinc.com For diluting EGF |
DMEM | GIBCO | 31966-021 | http://www.lifetechnologies.com/ Warm in 37 °C waterbath before use |
Fetal Bovine Serum | Biosera | 1001/500 | http://www.biosera.com Heat at 56 °C to inactivate complement before use |
TrypLE | GIBCO | 12605 | http://www.lifetechnologies.com/ Cell dissociation solution |
Celigo cytometer | Nexcelom Bioscience | n/a | http://www.nexcelom.com Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative |
IX70 inverted microscope | Olympus | n/a | http://www.olympus.co.uk/ Used with camera for manual image capture |
Retiga Exi Fast 1394 digital camera | Qimaging | n/a | http://www.qimaging.com/ Attached to microscope for manual image capture |
Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Software used to control camera and microscope for manual image capture |
Image-Pro Analyzer 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size |
Excel 2010 | Microsoft | n/a | http://www.microsoft.com/ Scientific graphing and statistical software |
Prism 6.0 | GraphPad | n/a | http://www.graphpad.com/ Scientific graphing and statistical software |