Zebra balığı Larva Görsel Tepki Elektroetinogram Analizi
Summary
We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.
Abstract
elektroretinogram (ERG) retina fonksiyonunu belirlemek için bir noninvaziv elektrofizyolojik yöntemdir. Kornea yüzeyi üzerinde bir elektrotun yerleşimi sayesinde, elektrik aktivitesi ölçülür ve in vivo olarak retina hücrelerinin faaliyetini değerlendirmek için kullanılabilen ışığa karşılık olarak oluşturdu. Bu makale zebrabalıkları görme fonksiyonu ölçmek için ERG kullanımını tarif eder. Balığı dolayı uzun morfolino oligonükleotitler ve farmakolojik manipülasyonu ile gen bastırma kolaylığı, omurgalı gelişimi için bir model olarak kullanılmıştır. 5-10 dpf'e, sadece konileri larva retinada işlevsel. Bu nedenle, zebra balığı ve diğer hayvanlarda farklı olarak, in vivo olarak koni görme fonksiyonu çalışma için güçlü bir model sistem. Bu protokol, standart anestezi, Mikromanipülasyondan ve zebra balığı araştırma yapmak laboratuvarlarda yaygın olan stereomikroskobi protokolleri kullanır. özetlenen yöntemler standart elektrofizyoloji eq faydalanmakuipment ve düşük ışık kamera larva kornea üzerine kayıt mikroelektrot yerleşimini rehberlik. Son olarak, ilk olarak farelerde kullanılmak üzere tasarlanmış bir ticari olarak temin edilebilir ERG uyarıcısı / kayıt cihazı kolayca zebrabalıkları ile kullanım için adapte edilebilir gösterilmektedir. Larva zebrabalıkları ERG bir morfolino oligonükleotid enjeksiyon ile tadil edilmiş olan hayvanlarda koni görme fonksiyonunu analiz etmek ve mükemmel bir yöntem olarak, örneğin çinko parmak Nükleaz (ZFNs) gibi daha yeni genom mühendislik teknikleri içerir, transkripsiyon aktivatör-gibi efektör Nükleaz (TALENS) ve Düzenli kümelenmiş interspaced Kısa yineleyen tekrarlar (CRISPR) / büyük ölçüde verimlilik ve zebrafish gen hedefleme etkinliğini artırmıştır hepsi Cas9. Ayrıca, biz photoresponse katkıda moleküler bileşenleri değerlendirmek için Zebra balığı larva nüfuz farmakolojik ajanların yeteneği yararlanmak. Bu protokol modifiye ve araştırmacılar tarafından kullanılabilecek bir kurulum özetliyorÇeşitli deneysel gol ile.
Introduction
elektroretinogram (ERG), insanlarda retina fonksiyonunu belirlemek için klinikte yaygın olarak kullanılan bir invazif olmayan elektrofizyolojik bir yöntemdir. Bir ışık uyarısına tepki olarak elektrik aktivitesi korneanın dış yüzeyi üzerinde kayıt elektrotları yerleştirilmesiyle ölçülür. uyarıcı paradigması ve tepki dalga özellikleri yanıt katkıda retina nöronlar tanımlar. Bu yöntem, fareler ve zebrabalıkları de dahil olmak üzere, hayvan modellerinde bir çok kullanım için adapte edilmiştir. Tipik omurgalı ERG tepki dört ana bileşeni vardır: fotoreseptör hücre aktivitesi türetilmiş bir kornea negatif potansiyel bir-dalga; b-dalgası, bipolar hücrelerden AÇIK türetilmiş bir kornea-pozitif potansiyeli; D-dalgası, KAPALI bipolar hücrelerin aktivitesi olarak yorumlanır bir kornea-pozitif potansiyeli; b-dalga sonra birkaç saniye içinde gerçekleştiğini ve c-dalga, Müller glia ve ret aktivite yansıtırinal pigment epiteli 1-4. İnsanlarda ve hayvanlarda modeli ERG analiz tarihini ve ilkelerini anlamak için Ek başvurular gibi İlkeleri ve Vizyon 4, 5 Klinik Elektrofizyoloji Uygulama olarak Utah ve metinlerin Üniversitesi'nden çevrimiçi ders kitabı, Webvision vardır.
Danio rerio (zebra balığı) uzun nedeniyle organ sistemlerinin, davranışsal testlerin noninvaziv morfolojik analiz ve ileri hem geri ve genetik ekranlar (inceleme için, Fadool ve görmek için izin veren hızlı olgunlaşma ve şeffaflık için, omurgalı gelişimi için bir model olarak tercih edilmiştir Dowling 6). Zebra balığı larvaları, yüksek doğurganlık ile birleştiğinde, onları yüksek verimli biyolojik analizler için mükemmel bir hayvan modeli yapmak genetik ve farmakolojik manipülasyon, son derece müsait. Larva zebrabalıkları çubuklara koni yüksek oranı – yaklaşık 1: 1 farelerinde (~% 3 koni ile karşılaştırıldığındalar) – koni fonksiyonu 7-9 çalışma için özellikle kullanışlı olmasını sağlar.
Gözdeki, koni çubuklar 10 önce gelişir. İlginç bir şekilde, zebra balığı koniler Bu aşamada 6, 11,12 koni seçici elektrofizyolojik analizine izin veren erken 4 dpf olarak işlemektedir. Buna karşılık, çubuklar ERG yanıtları 11 ve 21, 13 dpf'e arasında görünür. Bu nedenle, 4-7 de Zebra balığı larvaları dpf'e bir all-koni retina gibi fonksiyonel hizmet vermektedir. Ancak, 4-7 dpf larvaları yerli Fotopik ERG tepki b-dalgası hakimdir. (+) – – 2-amino-4-fosfono-butirik asit (L-AP4), metabotropik glutamat için bir agonist iki kutuplu hücreler üzerindeki tarafından ifade edilen (mGluR6) reseptörü, etkili bir şekilde bloke nesil L gibi farmakolojik ajanların uygulanması b-dalga ve izole koni reseptör potansiyeli kitle, ("a-dalgası") 14-17 ortaya koymaktadır.
Burada basit ve reliabl tarifzebra balığı larvası ile kullanım için adapte edilmiş fareler ile kullanım için tasarlanmış ticari olarak temin ERG ekipman kullanılarak ERG analizi e yöntemi. Bu sistem, görsel duyarlılık ve adaptasyona 16 katkı sinyal yollarının tanımlanması araştırmacılar yardımcı olmak için, bir genetik arka değişen, hem de farmakolojik maddeler ile tedavi gibi bir zebra balığı larva üzerinde kullanılabilir. Bu protokolde belirtilen deneysel prosedürler vizyona ilgili biyolojik soruları çeşitli cevap ERG analiz kullanımı araştırmacıları rehberlik ve esnek bir ERG kurulum inşaatı gösterecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol larva zebrafish ERG kayıtları için basit bir prosedür ayrıntılı. Akılda tutulmalıdır prosedür boyunca birçok kritik adımlar Bu prosedür görsel function.There hızlı ve kapsamlı bir tahlil için izin verir vardır. Deney potansiyel ilaç tedavileri sırasında ölümleri önlemek ve ERG kayıtları sırasında uzun süreli geçimini sağlamak için önce Zebra balığı larvaları sağlıklı olmalıdır. Buna ek olarak, bu deneylerde kullanılan larva yakın yaş uyumlu olması önemlidir. B…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description (optional) |
| Faraday cage | 80/20 Inc | custom | Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework |
| PVA sponge | Amazon | B000ZOWG1C | Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae |
| 150 ml Sterile Filter systems | Corning | 431154 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
| Espion E2 | Diagnosys, LLC | contact | Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com |
| Colordome | Diagnosys, LLC | contact | Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com |
| Micromanipulator | Drummond | 3-000-024-R | Holding and positioning the recording microelectrode |
| Magnetic ring stand | Drummond | 3-000-025-MB | Holding and positioning of the camera and refrence electrode |
| Lead extensions | Grass Technologies | F-LX | Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes |
| Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor | Grass Technologies | DF-215/10 | Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins |
| Window screen frame (metal) and spline | Lowes or Home Depot | various | For attaching copper mesh to Faraday cage framework |
| Steriflip 50 ml filters | Millipore | SCGP00525 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
| BNC adaptor | Monoprice | 4127 | Connecting camera to BNC cable |
| BNC cable | Monoprice | 626 | Connecting camera to video adaptor |
| Camera lens | Navitar | 1582232 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Camera coupler | Navitar | 1501149 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Luna BNC to VGA + HDMI Converter | Sewell | SW-29297-PRO | BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor |
| APB | Sigma | A1910 | mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential |
| Borosilicate glass | Sutter | BF-150-86-10 | Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter) |
| P97 Flaming/Brown puller | Sutter | P97 | For pulling glass micropipettes |
| Sorbothane sheet | Thorlabs | SB12A | Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size |
| Breadboard | Thorlabs | B2436F | Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen |
| Passive Isolation Mounts | Thorlabs | PWA074 | Provides vibration isolation to breadboard |
| Copper mesh | TWP | 022X022C0150W36T | To line Faraday Cage |
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae |
| Pasteur pipettes | VWR | 14672-608 | Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae |
| Camera | Watec | WAT-902B | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Tricaine (MS-222) | Western Chemical | Tricaine-S | Pharmaceutical-grade anesthetic, |
| Micro-fil | WPI | MF28G-5 | Filling microelectrode holder and microelectrode glass |
| Microelectrode holder | WPI | MEH2SW15 | Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment |
| Reference Electrode | WPI | DRIREF-5SH | Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode |
| Reference Electrode (alternative) | WPI | EP1 | Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead |
| Low-noise cable for Microelectrode holder | WPI | 13620 | Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard |
References
- Dowling, J. E. . The retina: an approachable part of the brain. , (1987).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
- Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. J Neurophysiol. 91, 1134-1142 (2004).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. . Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , (2006).
- Perlman, I., Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. . Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Fadool, J. M., Dowling, J. E. Zebrafish: a model system for the study of eye genetics. ProgRetin. Eye Res. 27, 89-110 (2008).
- Doerre, G., Malicki, J. Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina. Mech. Dev. 110, 125-138 (2002).
- Brockerhoff, S. E., et al. Light stimulates a transducin-independent increase of cytoplasmic Ca2+ and suppression of current in cones from the zebrafish mutant nof. J Neurosci. 23, 470-480 (2003).
- Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C. Knockdown of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response recovery and delayed dark adaptation. Neuron. 47, 231-242 (2005).
- Harada, T., Harada, C., Parada, L. F. Molecular regulation of visual system development: more than meets the eye. Genes Dev. 21, 367-378 (2007).
- Branchek, T. The development of photoreceptors in the zebrafish, brachydaniorerio. II. Function. J Comp Neurol. 224, 116-122 (1984).
- Schmitt, E. A., Dowling, J. E. Early retinal development in the zebrafish, Daniorerio: light and electron microscopic analyses. J Comp Neurol. 404, 515-536 (1999).
- Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Dev Dyn. 222, 564-570 (2001).
- Wong, K. Y., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Retinal bipolar cell input mechanisms in giant danio. I. Electroretinographic analysis. J Neurophysiol. 93, 84-93 (2005).
- Nelson, R. F., Singla, N. A spectral model for signal elements isolated from zebrafish photopicelectroretinogram. Vis Neurosci. 26, 349-363 (2009).
- Korenbrot, J. I., Mehta, M., Tserentsoodol, N., Postlethwait, J. H., Rebrik, T. I. EML1 (CNG-modulin) controls light sensitivity in darkness and under continuous illumination in zebrafish retinal cone photoreceptors. J Neurosci. 33, 17763-17776 (2013).
- Gurevich, L., Slaughter, M. M. Comparison of the waveforms of the ON bipolar neuron and the b-wave of the electroretinogram. Vision Res. 33, 2431-2435 (1993).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Daniorerio). , (2007).
- Kim, D. Y., Jung, C. S. Gap junction contributions to the goldfish electroretinogram at the photopic illumination level. Korean J PhysiolPharmacol. 16, 219-224 (2012).
- Brockerhoff, S. E., Dowling, J. E., Hurley, J. B. Zebrafish retinal mutants. Vision Res. 38, 1335-1339 (1998).
- Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from colour units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 536-555 (1966).
- Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 587-599 (1966).
- Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. J Neurosci. Methods. 159, 108-115 (2007).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. ProcNatlAcadSci. U S A. 92, 10545-10549 (1995).
- Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. CSH protocols. , (2008).
- Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Doc Ophthalmol. 104, 57-68 (2002).
- Kainz, P. M., Adolph, A. R., Wong, K. Y., Dowling, J. E. Lazy eyes zebrafish mutation affects Müller glial cells, compromising photoreceptor function and causing partial blindness. J Comp Neurol. 463, 265-280 (2003).
- Lewis, A., et al. Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina. PLoS. genetics. 7, e1002239 (2011).
