Análisis Electrorretinograma de la respuesta visual en pez cebra larvas

El electrorretinograma (ERG) es un método electrofisiológico no invasiva que se ha utilizado ampliamente en la clínica para determinar la función de la retina en los seres humanos. La actividad eléctrica en respuesta a un estímulo de luz se mide mediante la colocación de electrodos de registro en la superficie externa de la córnea. Las características del paradigma estímulo y la respuesta de la forma de onda definen las neuronas de la retina que contribuyen a la respuesta. Este método ha sido adaptado para su uso con un número de modelos animales, incluyendo ratones y pez cebra. La respuesta típica de vertebrados ERG tiene cuatro componentes principales: la onda a, que es un potencial córnea negativa derivada de la actividad de las células fotorreceptoras; la onda b, un potencial córnea positivo derivado de la EN células bipolares; la onda d, un potencial de córnea positiva interpretarse como la actividad de las células bipolares OFF; y la onda c, que se produce varios segundos después de la onda b y refleja la actividad en las células de Müller y la retinal epitelio pigmentario de ^1-4. Referencias adicionales para la comprensión de la historia y los principios de análisis de ERG en humanos y modelos animales son el libro de texto en línea, Webvision, de la Universidad de Utah y textos tales como los Principios y Práctica de Electrofisiología Clínica de la Visión ^{4, 5.}

Danio rerio (pez cebra) ha sido favorecido como un modelo para el desarrollo de vertebrados, debido a su rápida maduración y la transparencia, que permite el análisis morfológico no invasiva de órganos y sistemas, ensayos de comportamiento y de ambos adelante y atrás pantallas genéticos (para una revisión, ver Fadool y Dowling ^6). Larvas de pez cebra son altamente susceptibles de manipulación genética y farmacológica, que, cuando junto con su alta fecundidad, los hacen un excelente modelo animal para los análisis biológicos de alto rendimiento. La mayor proporción de conos para varillas en larvas de pez cebra – aproximadamente 1: 1 en comparación con ratones (~ 3% de conos) – hacen particularmente útiles para el estudio de la función de cono ^7-9.

En la retina de los vertebrados, los conos se desarrollan antes de varillas ^10. Curiosamente, los conos de pez cebra son operativos ya en 4 dpf, permitiendo selectiva análisis electrofisiológico de conos en esa etapa ^{6, 11,12.} En contraste, las respuestas de ERG en barras aparecen entre 11 y 21 dpf ^13. Por lo tanto, las larvas de pez cebra a 4-7 servir dpf funcionalmente como una retina todo-cono. Sin embargo, la respuesta fotópica nativo ERG de 4-7 larvas dpf está dominada por la onda b. La aplicación de agentes farmacológicos, tales como L – (+) – 2-amino-4-fosfono-butírico (L-AP4), un agonista para el glutamato metabotrópicos (mGluR6) receptor expresado por la sobre las células bipolares, bloquea eficazmente la generación de la onda b y revela el potencial de masa aislado cono receptor, (la "onda a") ^14-17.

Aquí se describe un simple y reliablmétodo para el análisis e ERG usando equipo ERG comercial, diseñado para su uso con ratones que han sido adaptados para su uso con las larvas de pez cebra. Este sistema puede ser utilizado en larvas de pez cebra de diferentes antecedentes genéticos, así como los tratados con agentes farmacológicos, para ayudar a los investigadores en la identificación de las vías de señalización que contribuyen a la sensibilidad visual y adaptación a la luz ^16. Los procedimientos experimentales descritos en este protocolo guiarán los investigadores en el uso del análisis de ERG para responder a una variedad de cuestiones biológicas relativas a la visión, y demostrar la construcción de una configuración flexible de ERG.