Электроретинограммы Анализ визуальной ответ в данио рерио Личинки
Summary
We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.
Abstract
Электроретинограммы (ERG) является неинвазивного электрофизиологического метода определения функции сетчатки. Путем размещения электрода на поверхности роговицы, электрической активности генерируется в ответ на света может быть измерена и использована для оценки активности клеток сетчатки в естественных условиях. Эта рукопись описывает использование ЭРГ для измерения зрительную функцию у рыбок данио. Данио рерио уже давно используется в качестве модели для позвоночных развития из-за легкости подавления генов с помощью морфолино олигонуклеотидов и фармакологической манипуляции. У 5-10 DPF, только шишки функционал в личиночной сетчатки. Таким образом, данио, в отличие от других животных, является мощным модельной системой для изучения конуса зрительной функции в живом организме. Этот протокол использует стандартный анестезии, микроманипуляция и стереомикроскопия протоколы, которые являются общими в лаборатории, которые проводят данио исследования. Изложенные методы использовать стандартный электрофизиологии эквоборудования, а также малой освещенности для направления размещения записи микроэлектрода на личиночной роговицы. Наконец, показано, как коммерчески доступный ЭРГ стимулятор / записывающее устройство первоначально разработана для использования с мышами могут быть легко адаптированы для использования с данио. ERG личинок рыбок данио обеспечивает отличную метод опробования конуса зрительную функцию у животных, которые были изменены морфолиновой инъекции олигонуклеотидов, а также новые технические методы, генома, такие как цинковый палец нуклеаз (ZFNs), активатора транскрипции-Like Effector Нуклеазы (Таленс), и Кластерные Регулярно Interspaced Короткие палиндромную повторов (CRISPR) / Cas9, все из которых привели к значительному увеличению эффективности и действенности генного таргетинга у рыбок данио. Кроме того, мы воспользуемся возможностью фармакологических агентов проникнуть данио личинки оценить молекулярные компоненты, которые способствуют фотоотклике. Этот протокол описывает установку, которая может быть изменена и используется исследователямис различных экспериментальных целей.
Introduction
Электроретинограммы (ERG) является неинвазивного электрофизиологического метода, который широко используется в клинике для определения функции сетчатки у людей. Электрической активности в ответ на световой раздражитель измеряется путем помещения записи электродов на внешней поверхности роговицы. Характеристики стимула парадигмы и сигнала отклика определить нейронов сетчатки, способствующих ответ. Этот метод был адаптирован для использования с рядом моделей животных, включая мышей и данио. Типичный позвоночных ответ ERG имеет четыре основных компонента: а-волна, которая роговица-отрицательный потенциал происходит от фоторецепторов активности клеток; б-волна, роговица-положительный потенциал происходит от биполярного клеток; D-Wave, роговица-положительный потенциал интерпретируется как деятельности ВЫКЛ биполярных клеток; и C-волна, которая наступает через несколько секунд после того, как б-волны и отражает деятельность в Müller глии и в отставкеИнал пигментный эпителий 1-4. Дополнительные ссылки для понимания истории и принципы анализа ERG в организме человека и модельных животных онлайн учебник, WebVision из Университета штата Юта и текстов, таких как Принципы и практика клинического электрофизиологии Видение 4, 5.
Danio rerio (данио) уже давно выступает в качестве модели для позвоночных развития, в связи с быстрым созреванием и прозрачность, что позволяет для неинвазивной морфологического анализа систем органов, поведенческих тестов и прямом и обратном генетических экранов (для обзора см Fadool и Даулинг 6). Данио рерио личинки очень поддается генетической и фармакологической манипуляции, которые, в сочетании с их высокой плодовитостью, сделать их отличная модель животного для высокопроизводительного биологического анализа. Чем выше отношение конусам, чтобы стержней в личиночной данио – примерно 1: 1 по сравнению с мышами (~ 3% конусаS) – делают их особенно полезными при изучении функции конуса 7-9.
В сетчатки позвоночных, конусы развивать до стержней 10. Интересно, что данио конусы действуют уже в 4 денье, позволяя селективного электрофизиологического анализа конусов на этом этапе 6, 11,12. В отличие от этого, ответы эрг стержней появляются между 11 и 21 DPF 13. Таким образом, данио личинки 4-7 DPF служить функционально, как все-конуса сетчатки. Тем не менее, родной фотопического ERG ответ 4-7 DPF личинок преобладают б-волны. Применение фармакологических агентов, таких как L – (+) – 2-амино-4-фосфоно-масл ную кислоту (L-АР4), агонист для метаботропного глутамата (mGluR6) рецептора выражается ПО биполярных клеток, эффективно блокирует генерации В-волны и раскрывает изолированный рецепторный потенциал конус массу, ("волны") 14-17.
Здесь мы опишем простой и reliablе метод анализа ERG с использованием коммерчески доступного ERG оборудование, предназначенное для использования с мышами, которые были адаптированы для использования с данио личинок. Эта система может быть использована на данио личинок различной генетический фон, а также у пациентов, получавших фармакологических агентов, чтобы помочь исследователей в определении путей, которые способствуют визуальной чувствительности и световой сигнализации 16 адаптации. Экспериментальные методики, изложенные в этом протоколе поможет следователям в использовании анализа ERG, чтобы ответить на различные биологические вопросов, относящихся к видению, а также продемонстрировать строительство гибкой настройки ERG.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе простая процедура ERG записи личинок рыбок данио подробно. Эта процедура позволяет быстро и всестороннего анализа визуального function.There несколько важных шагов в течение всей процедуры, которые должны храниться в памяти. Личинки данио должны быть здоровыми, прежде чем эк?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description (optional) |
| Faraday cage | 80/20 Inc | custom | Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework |
| PVA sponge | Amazon | B000ZOWG1C | Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae |
| 150 ml Sterile Filter systems | Corning | 431154 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
| Espion E2 | Diagnosys, LLC | contact | Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com |
| Colordome | Diagnosys, LLC | contact | Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com |
| Micromanipulator | Drummond | 3-000-024-R | Holding and positioning the recording microelectrode |
| Magnetic ring stand | Drummond | 3-000-025-MB | Holding and positioning of the camera and refrence electrode |
| Lead extensions | Grass Technologies | F-LX | Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes |
| Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor | Grass Technologies | DF-215/10 | Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins |
| Window screen frame (metal) and spline | Lowes or Home Depot | various | For attaching copper mesh to Faraday cage framework |
| Steriflip 50 ml filters | Millipore | SCGP00525 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
| BNC adaptor | Monoprice | 4127 | Connecting camera to BNC cable |
| BNC cable | Monoprice | 626 | Connecting camera to video adaptor |
| Camera lens | Navitar | 1582232 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Camera coupler | Navitar | 1501149 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Luna BNC to VGA + HDMI Converter | Sewell | SW-29297-PRO | BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor |
| APB | Sigma | A1910 | mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential |
| Borosilicate glass | Sutter | BF-150-86-10 | Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter) |
| P97 Flaming/Brown puller | Sutter | P97 | For pulling glass micropipettes |
| Sorbothane sheet | Thorlabs | SB12A | Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size |
| Breadboard | Thorlabs | B2436F | Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen |
| Passive Isolation Mounts | Thorlabs | PWA074 | Provides vibration isolation to breadboard |
| Copper mesh | TWP | 022X022C0150W36T | To line Faraday Cage |
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae |
| Pasteur pipettes | VWR | 14672-608 | Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae |
| Camera | Watec | WAT-902B | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Tricaine (MS-222) | Western Chemical | Tricaine-S | Pharmaceutical-grade anesthetic, |
| Micro-fil | WPI | MF28G-5 | Filling microelectrode holder and microelectrode glass |
| Microelectrode holder | WPI | MEH2SW15 | Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment |
| Reference Electrode | WPI | DRIREF-5SH | Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode |
| Reference Electrode (alternative) | WPI | EP1 | Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead |
| Low-noise cable for Microelectrode holder | WPI | 13620 | Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard |
References
- Dowling, J. E. . The retina: an approachable part of the brain. , (1987).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
- Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. J Neurophysiol. 91, 1134-1142 (2004).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. . Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , (2006).
- Perlman, I., Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. . Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Fadool, J. M., Dowling, J. E. Zebrafish: a model system for the study of eye genetics. ProgRetin. Eye Res. 27, 89-110 (2008).
- Doerre, G., Malicki, J. Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina. Mech. Dev. 110, 125-138 (2002).
- Brockerhoff, S. E., et al. Light stimulates a transducin-independent increase of cytoplasmic Ca2+ and suppression of current in cones from the zebrafish mutant nof. J Neurosci. 23, 470-480 (2003).
- Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C. Knockdown of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response recovery and delayed dark adaptation. Neuron. 47, 231-242 (2005).
- Harada, T., Harada, C., Parada, L. F. Molecular regulation of visual system development: more than meets the eye. Genes Dev. 21, 367-378 (2007).
- Branchek, T. The development of photoreceptors in the zebrafish, brachydaniorerio. II. Function. J Comp Neurol. 224, 116-122 (1984).
- Schmitt, E. A., Dowling, J. E. Early retinal development in the zebrafish, Daniorerio: light and electron microscopic analyses. J Comp Neurol. 404, 515-536 (1999).
- Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Dev Dyn. 222, 564-570 (2001).
- Wong, K. Y., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Retinal bipolar cell input mechanisms in giant danio. I. Electroretinographic analysis. J Neurophysiol. 93, 84-93 (2005).
- Nelson, R. F., Singla, N. A spectral model for signal elements isolated from zebrafish photopicelectroretinogram. Vis Neurosci. 26, 349-363 (2009).
- Korenbrot, J. I., Mehta, M., Tserentsoodol, N., Postlethwait, J. H., Rebrik, T. I. EML1 (CNG-modulin) controls light sensitivity in darkness and under continuous illumination in zebrafish retinal cone photoreceptors. J Neurosci. 33, 17763-17776 (2013).
- Gurevich, L., Slaughter, M. M. Comparison of the waveforms of the ON bipolar neuron and the b-wave of the electroretinogram. Vision Res. 33, 2431-2435 (1993).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Daniorerio). , (2007).
- Kim, D. Y., Jung, C. S. Gap junction contributions to the goldfish electroretinogram at the photopic illumination level. Korean J PhysiolPharmacol. 16, 219-224 (2012).
- Brockerhoff, S. E., Dowling, J. E., Hurley, J. B. Zebrafish retinal mutants. Vision Res. 38, 1335-1339 (1998).
- Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from colour units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 536-555 (1966).
- Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 587-599 (1966).
- Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. J Neurosci. Methods. 159, 108-115 (2007).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. ProcNatlAcadSci. U S A. 92, 10545-10549 (1995).
- Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. CSH protocols. , (2008).
- Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Doc Ophthalmol. 104, 57-68 (2002).
- Kainz, P. M., Adolph, A. R., Wong, K. Y., Dowling, J. E. Lazy eyes zebrafish mutation affects Müller glial cells, compromising photoreceptor function and causing partial blindness. J Comp Neurol. 463, 265-280 (2003).
- Lewis, A., et al. Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina. PLoS. genetics. 7, e1002239 (2011).
