Zebrafish लार्वा में दृश्य प्रतिक्रिया के Electroretinogram विश्लेषण
Summary
We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.
Abstract
electroretinogram (एर्ग) रेटिना समारोह का निर्धारण करने के लिए एक noninvasive electrophysiological विधि है। कॉर्निया की सतह पर एक इलेक्ट्रोड की नियुक्ति के माध्यम से, बिजली की गतिविधि मापा जाता है और इन विवो में रेटिना की कोशिकाओं की गतिविधि का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रकाश के जवाब में उत्पन्न। इस पांडुलिपि zebrafish में दृश्य समारोह को मापने के लिए एर्ग के उपयोग का वर्णन है। Zebrafish लंबे कारण morpholino oligonucleotides और औषधीय हेरफेर से जीन दमन की आसानी के लिए हड्डीवाला विकास के लिए एक मॉडल के रूप में उपयोग किया गया है। 5-10 DPF पर, केवल शंकु लार्वा रेटिना में कार्य कर रहे हैं। इसलिए, zebrafish, अन्य जानवरों के विपरीत, विवो में कोन दृश्य समारोह के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है। इस प्रोटोकॉल मानक संज्ञाहरण, micromanipulation और zebrafish अनुसंधान करते हैं कि प्रयोगशालाओं में आम हैं कि stereomicroscopy प्रोटोकॉल का उपयोग करता है। उल्लिखित तरीकों मानक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी EQ का उपयोग करनाuipment और एक कम लाइट कैमरा लार्वा कॉर्निया पर रिकॉर्डिंग microelectrode की नियुक्ति मार्गदर्शन करने के लिए। अंत में, हम मूल रूप से चूहों के साथ प्रयोग के लिए डिजाइन एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एर्ग उत्तेजक / रिकॉर्डर आसानी से zebrafish के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि कैसे प्रदर्शित करता है। लार्वा zebrafish के एर्ग एक morpholino oligonucleotide इंजेक्शन द्वारा संशोधित किया गया है कि पशुओं में कोन दृश्य समारोह परख करने की क्रिया के उत्कृष्ट पद्धति के रूप में अच्छी तरह से जैसे जिंक फिंगर न्युक्लिअसिज़ (ZFNs) के रूप में नए जीनोम इंजीनियरिंग तकनीक प्रदान करता है, प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह effector के न्युक्लिअसिज़ (TALENS), और नियमित रूप से संकुल interspaced लघु मुरजबंध संबंधी पुनर्प्रसारण (CRISPR) / बहुत दक्षता और zebrafish में लक्षित जीन की प्रभावकारिता में वृद्धि हुई है, जो सभी के Cas9,। इसके अलावा, हम photoresponse के लिए योगदान है कि आणविक घटकों का मूल्यांकन करने के लिए zebrafish लार्वा घुसना करने के लिए औषधीय एजेंटों की क्षमता का लाभ ले। इस प्रोटोकॉल संशोधित और शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक सेटअप की रूपरेखाविभिन्न प्रयोगात्मक लक्ष्यों के साथ।
Introduction
electroretinogram (एर्ग) मनुष्यों में रेटिना के समारोह का निर्धारण करने के लिए क्लिनिक में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है कि एक noninvasive electrophysiological विधि है। एक प्रकाश उत्तेजना के जवाब में बिजली की गतिविधि कॉर्निया की बाहरी सतह पर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड रखकर मापा जाता है। उत्तेजना प्रतिमान और प्रतिक्रिया तरंग की विशेषताओं प्रतिक्रिया के लिए योगदान दे रेटिना न्यूरॉन्स को परिभाषित। इस विधि चूहों और zebrafish सहित पशु मॉडलों के एक नंबर के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया गया है। ठेठ कशेरुकी एर्ग प्रतिक्रिया चार प्रमुख घटक हैं: फोटोरिसेप्टर सेल गतिविधि से प्राप्त कॉर्निया नकारात्मक संभावित है, जो एक-लहर; बी-लहर, द्विध्रुवी कोशिकाओं से व्युत्पन्न एक कॉर्निया पॉजिटिव संभावित; D-लहर रवाना द्विध्रुवी कोशिकाओं की गतिविधि के रूप में व्याख्या एक कॉर्निया पॉजिटिव संभावित; और बी-लहर के बाद कई सेकंड होती है और जो सी-लहर, मुलर glia और रेत में गतिविधि को दर्शाता हैinal वर्णक उपकला 1-4। मनुष्य और मॉडल पशुओं में एर्ग विश्लेषण के इतिहास और सिद्धांतों को समझने के लिए अतिरिक्त संदर्भ में इस तरह के सिद्धांतों और विजन 4, 5 के नैदानिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के अभ्यास के रूप यूटा और ग्रंथों के विश्वविद्यालय से ऑनलाइन पाठ्यपुस्तक, Webvision, कर रहे हैं।
देनियो rerio (zebrafish) लंबे समय के कारण अंग प्रणालियों, व्यवहार assays के noninvasive रूपात्मक विश्लेषण और आगे दोनों और रिवर्स आनुवंशिक स्क्रीन (समीक्षा के लिए, Fadool और देखने के लिए अनुमति देता है जो अपनी तेजी से परिपक्वता और पारदर्शिता के लिए, हड्डीवाला विकास के लिए एक मॉडल के रूप में इष्ट किया गया है Dowling 6)। Zebrafish लार्वा, उनके उच्च उपजाऊपन के साथ युग्मित है, जब उन्हें उच्च throughput जैविक विश्लेषण के लिए एक उत्कृष्ट पशु मॉडल बनाने के लिए जो आनुवंशिक और औषधीय हेरफेर करने के लिए अत्यधिक उत्तरदायी हैं। लार्वा zebrafish में छड़ को शंकु के उच्च अनुपात – मोटे तौर पर 1: 1 चूहों (~ 3% शंकु की तुलनास) – कोन समारोह 7-9 के अध्ययन के लिए उन्हें विशेष रूप से उपयोगी है।
हड्डीवाला रेटिना में, शंकु छड़ 10 से पहले का विकास। दिलचस्प है, zebrafish शंकु कि स्टेज 6, 11,12 पर शंकु के चुनिंदा electrophysiological विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, के रूप में जल्दी 4 DPF रूप ऑपरेटिव हैं। इसके विपरीत, छड़ में एर्ग प्रतिक्रियाओं 11 और 21 से 13 DPF के बीच दिखाई देते हैं। इसलिए, 4-7 पर zebrafish लार्वा DPF एक सब-कोन रेटिना के रूप में कार्यात्मक रूप में सेवा करते हैं। हालांकि, 4-7 DPF लार्वा की देशी photopic एर्ग प्रतिक्रिया बी-लहर का प्रभुत्व है। (+) – – 2-अमीनो-4-phosphono-butyric एसिड (एल AP4), metabotropic ग्लूटामेट के लिए एक agonist द्विध्रुवी कोशिकाओं द्वारा व्यक्त (mGluR6) रिसेप्टर को प्रभावी ढंग से ब्लॉक पीढ़ी ऐसे एल के रूप में औषधीय एजेंटों के आवेदन बी-लहर की और पृथक कोन बड़े पैमाने पर रिसेप्टर संभावित ("एक लहर") 14-17 पता चलता है।
यहाँ हम एक सरल और reliabl का वर्णनzebrafish लार्वा के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया गया है कि चूहों के साथ प्रयोग के लिए बनाया व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एर्ग उपकरण का उपयोग कर एर्ग विश्लेषण के लिए ई विधि। इस प्रणाली के दृश्य संवेदनशीलता और प्रकाश अनुकूलन 16 के लिए योगदान है कि रास्ते संकेतन की पहचान में शोधकर्ताओं सहायता करने के लिए, आनुवंशिक पृष्ठभूमि बदलती है, साथ ही औषधीय एजेंटों के साथ इलाज के रूप में उन की zebrafish लार्वा पर उपयोग किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं दृष्टि से संबंधित जैविक सवालों की एक किस्म का जवाब देने के एर्ग विश्लेषण के उपयोग में जांचकर्ताओं को मार्गदर्शन, और एक लचीला एर्ग सेटअप के निर्माण का प्रदर्शन करेंगे।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में लार्वा zebrafish के एर्ग रिकॉर्डिंग के लिए एक सरल प्रक्रिया विस्तृत है। ध्यान में रखा जाना चाहिए कि प्रक्रिया के दौरान कई महत्वपूर्ण कदम यह प्रक्रिया दृश्य function.There की एक त्वरित और व्यापक परख …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description (optional) |
| Faraday cage | 80/20 Inc | custom | Custom designed aluminum "Industrial Erector Set" for Cage framework |
| PVA sponge | Amazon | B000ZOWG1C | Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae |
| 150 ml Sterile Filter systems | Corning | 431154 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
| Espion E2 | Diagnosys, LLC | contact | Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com |
| Colordome | Diagnosys, LLC | contact | Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com |
| Micromanipulator | Drummond | 3-000-024-R | Holding and positioning the recording microelectrode |
| Magnetic ring stand | Drummond | 3-000-025-MB | Holding and positioning of the camera and refrence electrode |
| Lead extensions | Grass Technologies | F-LX | Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes |
| Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor | Grass Technologies | DF-215/10 | Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins |
| Window screen frame (metal) and spline | Lowes or Home Depot | various | For attaching copper mesh to Faraday cage framework |
| Steriflip 50 ml filters | Millipore | SCGP00525 | Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes |
| BNC adaptor | Monoprice | 4127 | Connecting camera to BNC cable |
| BNC cable | Monoprice | 626 | Connecting camera to video adaptor |
| Camera lens | Navitar | 1582232 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Camera coupler | Navitar | 1501149 | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Luna BNC to VGA + HDMI Converter | Sewell | SW-29297-PRO | BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor |
| APB | Sigma | A1910 | mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential |
| Borosilicate glass | Sutter | BF-150-86-10 | Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821°C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter) |
| P97 Flaming/Brown puller | Sutter | P97 | For pulling glass micropipettes |
| Sorbothane sheet | Thorlabs | SB12A | Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size |
| Breadboard | Thorlabs | B2436F | Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen |
| Passive Isolation Mounts | Thorlabs | PWA074 | Provides vibration isolation to breadboard |
| Copper mesh | TWP | 022X022C0150W36T | To line Faraday Cage |
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae |
| Pasteur pipettes | VWR | 14672-608 | Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae |
| Camera | Watec | WAT-902B | Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea |
| Tricaine (MS-222) | Western Chemical | Tricaine-S | Pharmaceutical-grade anesthetic, |
| Micro-fil | WPI | MF28G-5 | Filling microelectrode holder and microelectrode glass |
| Microelectrode holder | WPI | MEH2SW15 | Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment |
| Reference Electrode | WPI | DRIREF-5SH | Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode |
| Reference Electrode (alternative) | WPI | EP1 | Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead |
| Low-noise cable for Microelectrode holder | WPI | 13620 | Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard |
References
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