Elektroretinogrammet Analyse af Visual respons i zebrafisk Larver

Elektroretinogrammet (ERG) er en non-invasiv elektrofysiologisk metode, der har været anvendt i udstrakt grad i klinikken til at bestemme funktionen af ​​nethinden hos mennesker. Den elektriske aktivitet som respons på en lys-stimulering måles ved at placere optagelse elektroder på den ydre overflade af hornhinden. Kendetegnene for stimulus paradigme og svaret bølgeform definerer de retinale neuroner, der bidrager til svaret. Denne fremgangsmåde er blevet tilpasset til anvendelse med en række dyremodeller, herunder mus og zebrafisk. Den typiske hvirveldyr ERG respons har fire hovedkomponenter: a-bølge, som er en hornhinde-negative potentiale afledt fra fotoreceptor celleaktivitet; b-bølge, en hornhinde-positivt potentiale afledt af ON bipolare celler; d-bølge, en hornhinde-positive potentiale tolkes som aktiviteten af ​​OFF bipolære celler; og c-bølge, som forekommer flere sekunder efter b-bølge og afspejler aktivitet i Müller glia og RETginal pigment epitel ^1-4. Yderligere referencer for at forstå historien og principperne for ERG analyse hos mennesker og dyremodeller er online lærebog, WebVision, fra University of Utah og tekster såsom principperne og praksis for Klinisk Elektrofysiologi af Vision ^{4, 5.}

Danio rerio (zebrafisk) har længe været begunstiget som en model for hvirveldyr udvikling, på grund af sin hurtige modning og gennemsigtighed, som giver mulighed for noninvasiv morfologisk analyse af organsystemer, adfærdsmæssige analyser og fremadgående og tilbagegående genetiske skærme (til gennemgang, se Fadool og Dowling ^6). Zebrafisk larver er meget modtagelige for genetisk og farmakologisk manipulation, som, når kombineret med deres høje frugtbarhed, gør dem en fremragende dyremodel for højt gennemløb biologiske analyser. Jo højere forholdet mellem kegler til stænger i larvernes zebrafisk – ca. 1: 1 i forhold til mus (~ 3% kegles) – gør dem særligt anvendelige til undersøgelse af kegle funktion ^7-9.

I hvirveldyr nethinden, kegler udvikle før stængerne ^10. Interessant, zebrafisk kegler er operative så tidligt som 4 dpf, der giver mulighed for selektiv elektrofysiologisk analyse af kegler på det tidspunkt ^{6, 11,12.} I modsætning hertil ERG respons i stænger vises mellem 11 og 21 dpf ^13. Derfor zebrafisk larver på 4-7 dpf tjene funktionelt som en all-kegle nethinden. Imidlertid er det native fotopiske ERG respons på 4-7 dpf larver domineret af b-bølgen. Anvendelse af farmakologiske midler, såsom L – (+) – 2-amino-4-phosphono-smørsyre (L-AP4) en agonist for metabotrope glutamatreceptorer (mGluR6) receptor ved den udtrykkes på bipolære celler, effektivt blokerer generation af b-bølge og afslører den isolerede kegle masse receptor potentiale ("a-bølge") ^14-17.

Her beskriver vi en enkel og reliable fremgangsmåde til ERG analyse under anvendelse af kommercielt tilgængelige ERG udstyr beregnet til brug med mus, der er blevet tilpasset til brug med zebrafisk larver. Dette system kan anvendes på zebrafisk larver af varierende genetiske baggrunde, såvel som dem behandlet med farmakologiske midler, for at hjælpe forskerne i identifikationen af signalveje, der bidrager til visuel følsomhed og let tilpasning ^16. De eksperimentelle procedurer i denne protokol vil guide efterforskere i brugen af ​​ERG analyse til at besvare en række biologiske spørgsmål vedrørende visioner, og demonstrere opbygningen af ​​en fleksibel ERG setup.