This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.
Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-α subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-λ2 and -λ3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.
Typene I og III-interferoner (IFN) er kritiske i immunresponsen mot virus og andre sykdomsfremkallende stimuli og er til stede i alle virveldyr 1. Immune og ikke-immunceller uttrykker og utskiller, samt svare til, IFN 2. Medfødte immun sensorer, for eksempel toll-like reseptorer (TLR), STING, og RIG-I, indusere type I og III IFN uttrykk ved deteksjon av patogen assosiert molekylære mønstre (pamp) 3,4. Hos mennesker, type I IFN inkluderer IFN-β, -ω, -κ, og 12 undergrupper av IFN-α, og binder seg til IFNAR1 / IFNAR2 reseptor kompleks 2,5. Type III IFN inkluderer IFN-λ1, -λ2, og -λ3 og binde til IL10RB / IL28RA reseptor kompleks 2. Klassisk, type I og III IFN binder seg til sine respektive reseptor komplekser som deretter rekruttere STAT1 / STAT2 heterodimerer og initiere transkripsjon av interferon stimulert gener (ISG) 6. ISG er involvert i en rekke ulike funksjoner, fra antiviral og antiproliferativ aktivitet til aktivering av den adaptive immunrespons 7.
De mange mekanismer patogener har utviklet seg til å lure seg unna, styrte, og kapre elementer av IFN signalveien vise betydningen av IFN i det medfødte immunrespons 8. For eksempel uttrykker vacciniavirus en lokkedue reseptor med IFNAR1 homologi som sequesters type I IFN 9 mens en Yaba-lignende sykdom virus utskiller et glykoprotein som hemmer Type I og III IFN proteiner 10. I tillegg til sin rolle i vertens forsvar, er IFN også implisert i kreft overvåking og et antall auto inflammatoriske sykdommer: lyddemping av IFN-ekspresjon i brystkreftceller begrenser immunosurveillance 11, er overproduksjon av IFN-α en mekanisme i utviklingen av systemisk lupus erythematosus 12, og villfaren aktivering av STING fører til systemisk betennelse forårsaket av overdreven mengder IFN i STING-assosiert vaskulopati13. Terapeutisk, IFN brukes til å behandle multippel sklerose 14, kroniske virale infeksjoner som HBV 15 og HCV 16,17, og kreftformer som hårcelleleukemi 18 og kronisk myelogen leukemi 19. Spørsmål om relevansen av IFN i en bestemt fysiologisk prosess kontinuerlig avsløre den allestedsnærværende natur av denne cytokin familien.
Type I IFN, spesielt IFN-α subtyper, blir ofte betraktet som en enhet 20 til 23, i stedet for som en gruppe av nært beslektede, men distinkte, proteiner. Eksistensen og utholdenhet av flere IFN arter inkludert IFN-α subtyper, hele virveldyr evolusjon 24 antyder at minst en undergruppe av disse undertypene har spesielle eller unike funksjoner. Det er mulig at definerende mønstre av IFN uttrykket vil tyde og hjelpe karakteriserer de spesifikke funksjoner av en eller flere av de undertyper 17. Utfordringen med å studere tHan type I og III IFN-subtyper er basert på deres felles sekvensidentitet: de tolv IFN-α subtyper har> 50% 25 og IFN-λ subtyper dele 81-96% 26 av deres aminosyresekvenser. I den beskrevne QRT-PCR-analyse, molekyl radiofyr (MB) og låst nukleinsyre (LNA) fluorescerende prober diskriminere enkle basepar forskjeller mellom de tilsvarende høyt IFN-undertype-sekvenser og tillate karakterisering av IFN-ekspresjon signatur. Analysen er 384-brønns plate format omfatter både kvantitative (transkripsjon standarder) og semi-kvantitative (housekeeping gener (HKG)) tiltak, noe som åpner for analyse av transkripsjon kopi nummer og ΔCq hhv. Batch montering, tilrettelagt av automatiserte multikanal pipettering, og langtidslagring, mulig gjennom tørking av primer / probe (Pr / Pb) setter på platene, forbedre reproduserbarhet, verktøyet, og praktisk bruk av analysen.
Denne protokollen beskriver prosessenfor fremstilling av 384-brønners QRT-PCR-assay-plater (figur 1) med opp til sytten forskjellige Pr / Pb sett rettet mot humant IFN-subtyper (tabell 1). Pr / Pb innstilte lager kildeplater (figur 2) brukes til å forberede flere 384-godt analyseplatene i en prosess som kan automatiseres ved hjelp av en robot multikanalpipette. Når det første fokusert på å skape en protokoll for å studere humane IFN uttrykk signaturer har denne metoden er anvendt på rhesus-aper i tillegg. Selv om plate oppsett er litt annerledes og Pr / Pb sett (Tabell 2) er tydelig, er den samlede forberedelse metode for å lage de menneskelige og rhesus plater identiske. Med minimale modifikasjoner av protokollen, kan fremgangsmåten bli utført for å tillate utvikling av analyser for å studere andre grupper av nært beslektede gener.
Se figurene 1 og 2. Her
Se tabellene 1 og 2 Below
Rapporten beskriver konstruksjon, satsvis produksjon, og en tilnærming til analyse av en analyse for å måle transkripsjon av et sett av svært lignende gener i et forskningslaboratorium innstilling. Den høy gjennomstrømming QRT-PCR-analysen rapporteres her måler IFN og – λ undergrupper med høy spesifisitet. Denne metoden innebærer to viktige aspekter, utforming av Pr / Pb settene som diskriminerer mellom medlemmer av en homolog genfamilien og utvikling av en produksjonsplattform for etablering av pålitelige og konsistente 384-brønners analyseplater forhåndslastet med Pr / Pb sett. QRT-PCR-sonder innlemme en strukturell (MB) eller kjemisk (LNA) tilnærming for å styrke deres spesifisitet 29. For to av primersettene i rhesus-analysen (Tabell 2), ble amplifikasjon-ildfast mutasjon system (ARMS) innarbeidet i primersekvenser for ytterligere å forbedre spesifisiteten 30. Mens det er vanligvis best å målrette exon-ekson veikryss til enhance spesifisiteten av en QRT-PCR-reaksjon, var dette ikke mulig fordi den type I IFN-gener mangler introner. Derfor vil genomisk DNA amplifiseres i PCR-reaksjonen, og må nedbrytes ved DNase-behandling etter at RNA-ekstraksjon.
Målområdet for Pr / Pb settene var begrenset til de kodende områder i det modne peptid for hver IFN. På grunn av den høye sekvenslikhet mellom IFN-α undertyper, spesielt det modne peptid regionen, var det noen ganger nødvendig å inngå kompromiss sensitivitet for å sikre spesifisitet. Dette var spesielt tilfelle med IFN-α17, hvor modne peptid transkripsjon har bare fire unike baser når sammenlignet mot de andre IFN-α subtyper. Målretting IFN-α17 nødvendig primere som binder transkripsjoner av flere undergrupper, begrenser spesifisitet til sonden. Som en konsekvens, vil PCR-reaksjonen forsterke andre undertyper enn IFN-α17, for derved å forbruke en betydelig prosentandel av PCR-reagenser og lowering amplituden av fluorescens-signalet fra den spesifikke probe for IFN-α17. En ytterligere utfordring mot utforme sensitive og spesifikke Pr / Pb sett for høyt lignende gener slik som IFN, er muligheten for at kommenterte sekvenser i GenBank databasen ikke kan være fullstendig eller fullstendig ved design. Igjen, dette var en utfordring for IFN-α17, der nylig kommenterte sekvenser ikke helt på linje med den versjonen av sekvensen i databasen på tidspunktet for design. Derfor, når du utformer Pr / Pb setter for gener som ikke har vært intensivt studert, er det lurt å regelmessig sjekke siste kommenterte sekvens av et mål genet. Til slutt, er det nødvendig å sikre at de Pr / Pb sett ikke forsterke pseudogener som kan transkriberes men ikke oversatt.
Etter utforme de Pr / Pb sett, er den neste utfordringen å optimalisere PCR betingelser for sytten forskjellige Pr / Pb setter på en 384-brønners plate. Transkripsjon standarder er vik-tant i å teste spesifisitet av en Pr / Pb sett og blitt viktig for å harmonisere QRT-PCR-betingelser for de mange ulike PCR reaksjoner. Teste en Pr / Pb sett mot karakterutskriften standarder etablerer sin effektivitet og følsomhet; plasmider som uttrykker svært lignende pseudogener kan være nødvendig for å sikre at Pr / Pb satt måler selektivt transkripsjon av det funksjonelle genet. Transkripsjonen standardene gir også et middel for kvantitativ analyse (antall transkripter), i tillegg til den semi-kvantitativ analyse i forhold til en husholdningsgenet (ΔCq).
Robotflerkanals pipettering av en 96-brønns plate kilde i flere 384-brønners analyseplater forbedrer presisjon og konsistensen av inter-plate resultater. Laksesperm DNA (ssDNA) blir brukt som en bærer som stabiliserer og bevarer Pr / Pb sett for langtidslagring, som gjør tørking av reagensene dispensert inn i platene. Tørking av platene også reduserer volumet av reaksjonsnødvendig for reproduserbare resultater, som i sin tur bevarer dyreprøver og reduserer bruken av kostbare reagenser. Gjennom disse trinnene, er grupper av plater montert som gir presisjon og konsistens i mer enn seks måneder.
Etter plate forberedelse, kvalitetskontroll tiltak er avgjørende for å kontrollere konsistensen av en bunke med plater. For dette formål er en ytterligere fire sett av standarder kjørt på en plate. Den "5x standard" plate sporer ytelse og skaper et datasett som en enkelt plate standarder sammenlignes. Mens ti 10-gangers fortynninger av hver standard anvendes under analysedesign, plasshensyn krever at fire punkter er benyttet for standardkurven på hver analyseplate, og for 5 x standard plate. I tillegg bør en positiv kontroll være inkludert på hver plate for å sikre gyldigheten av platen.
Vanligvis tar det 3-4 timer å forberede seks analyseplater fra en Pr / Pb source plate; det er mulig å forberede tolv plater på en enkelt dag i et forskningslaboratorium. Siden hvert menneske IFN subtype analyseplaten undersøker sytten Pr / Pb sett og rommer femten eksperimentelle prøver, produserer en dag av forsamlingen en bunke med plater med kapasitet til å generere opp til 3060 eksperimentelle datapunkter. Rådata fra QRT-PCR-plattformen kan behandles og monteres ved hjelp av programmering skript i et regnearkprogram programvare for å fylle en forhåndsutformet analyse mal automatisk. Denne metoden minimerer hands-on dataregistrering, og dermed hindre kopiering feil og lar etterforsker for å fokusere på dataanalyse fremfor data montering. Som beskrevet her, kan denne high-throughput QRT-PCR-analyse anvendes for å måle ekspresjonen av interferon undertyper i menneske eller Rhesusape prøver og kan tilpasses til bruk for andre arter eller homologe gen sett. Fleksibiliteten av platen oppsettet gjør det mulig for brukeren å endre primer / probe-sett for å skreddersy generinteressen mot en bestemt celletype eller modellsystem. Denne analysen kan brukes til å måle IFN uttrykk signaturer i cellekulturmodeller studerer patogener eller i pasientprøver i forbindelse med sykdomsmodeller til å belyse de signaleringsmekanismer som er involvert i immunresponsen.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av CBER / FDA-NIAID / NIH Interagency avtalen YI-AI-6153-01, FDA / CBER egenutført midler, og FDA medisinske mottiltak Initiative. TCT, MNB, VPM, LMS, og KDK ble støttet av en avtale til Forsknings Deltakelse Program ved Center for biologiske Evaluering og forskning administreres av Oak Ridge Institute for Science Education gjennom en Interagency avtalen mellom USA departmen of Energy og USA Food and Drug Administration.
0.2mL PCR Tube Strips | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | E0030 124 286 | |
12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-139 | *Discontinued |
12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-137 | *Discontinued |
12-channel Electronic Pipette, 5-250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-118 | *Discontinued |
2.0mL Micro Centrifuge tube, sterile | Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA) | 229446 | |
8-channel Electronic Pipette, 15-1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-115 | *Discontinued |
Disposable Reagent Reservoirs | VWR International (Radnor, PA, USA) | 89094-668 | 25mL reservoirs with 2 dividers |
E-Centrifuge | Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA) | 1090003 | |
Eukaryotic 18S rRNA (18S) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs99999901_s1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
Fixed Speed Mini Vortexer | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 02-215-360 | |
Gas Permeable Adhesive Plate Seal | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB-0580 | Disposable plate seal used during the plate preparation process |
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | Human HKG Primer/probe set |
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Rh02621745_g1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
Hudson Solo automated multichannel pipettor | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800200 | Modified with a 384-well cooling nest |
Linearized plasmids (IFN genes) | Aldevron (Fargo, ND, USA) | Custom Order | Item 3000, 3580; used for assay standards |
LNA inhibitors | Exiqon (Woburn, MA, USA) | Custom Order | Item 500100 |
LNA Probes | Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA) | Custom Order | Material number VC00023 |
Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-193 | |
Matrix Filtered Pipet Tips, 30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-196 | |
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-160 | |
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-152 | |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4309849 | |
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | N8010560 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4311971 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
Microsoft Excel 2010 Spreadsheet | Microsoft (Redmond, WA, USA) | Office 2010 | Visual Basic programming language |
MixMate Vortex Mixer | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | 5353 000.014 | 2 dimensional plate vortex apparatus |
Molecular Beacon Probes | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | Z606634-1EA | |
Plate Dryer (manifold) | Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA) | Custom Order | |
Primer sets | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
pUC57 plasmid DNA | Genescript (Piscataway, NJ, USA) | SD1176 | |
Rnase-Free 1.5mL Microfuge Tubes | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | AM12400 | |
RNase-free DNase Set (50) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 79254 | |
RNase H | New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA) | M0297L | |
RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 74106 | |
Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips) | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800350-S | |
Salmon Sperm DNA Solution | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 15632-011 | |
SoftLinx Version V | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | Custom Order | Software for programming pipetting steps |
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | 4352042 | |
ABgene Adhesive Plate Seals | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB0580 | |
Ubiquitin C (UBC) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs01871556_s1 | Human HKG Primer/probe set |
Verso cDNA synthesis Kit | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB1453B | |
ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4453536 | |
Water-Ultra Pure | Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA) | 351-029-101 | |
Zipvap 384 (plate dryer heating element) | Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA) | 384-109A | Plate Dryer |