This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.
Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-α subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-λ2 and -λ3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.
Type I en III interferonen (IFN) zijn cruciaal in de immuunrespons tegen virussen en andere pathogene stimuli en in alle vertebraten 1. Immuun en niet-immuun cellen tot expressie en scheiden, en reageren op IFN 2. Aangeboren immuunsysteem sensoren, zoals toll-like receptoren (TLR), Sting, en RIG-I, induceren type I en III IFN expressie bij detectie van pathogenen geassocieerde moleculaire patronen (PAMP) 3,4. Bij mensen type I IFN omvatten IFN-β, -ω, -κ en 12 subtypen van IFN-α, en binden aan het IFNAR1 / IFNAR2 receptorcomplex 2,5. Type III IFN onder IFN-λ1, -λ2 en -λ3 en binden aan de IL10RB / IL28RA receptor complex 2. Klassiek, typen I en III IFN binden aan hun respectievelijke receptor complexen die vervolgens rekruteren STAT1 / STAT2 heterodimeren en initiëren transcriptie van interferon gestimuleerde genen (ISG) 6. ISG zijn betrokken bij een breed scala aan functies, van antivirale en antiproliferatieve activiteit activatie van de adaptieve immuunrespons 7.
De talrijke mechanismen pathogenen zijn geëvolueerd te ontwijken, ondermijnen en kapen elementen van het IFN signaalweg tonen het belang van IFN in de aangeboren immuunrespons 8. Bijvoorbeeld vacciniavirus drukt een lokreceptor met IFNAR1 homologie dat sequesters type I IFN 9 terwijl een Yaba-achtig virus van de ziekte scheidt een glycoproteïne dat remt type I en III IFN eiwitten 10. Naast hun rol bij de afweer worden IFN ook betrokken bij kanker surveillance en een aantal auto-inflammatoire aandoeningen: silencing van IFN expressie in borstkankercellen beperkt immunosurveillance 11, overproductie van IFN-α is een mechanisme in de ontwikkeling van systemische lupus erythematosus 12, en dolende activering van STING leidt tot systemische ontsteking veroorzaakt door overmatige hoeveelheden IFN in-STING geassocieerd vasculopathy13. Therapeutisch IFN gebruikt om multiple sclerose te behandelen 14, chronische virale infecties zoals HBV en HCV 15 16,17 en kankers zoals hairy cell leukemie en 18 chronische myelogene leukemie 19. Vragen over de relevantie van IFN in een bepaald fysiologisch proces continu onthullen de alomtegenwoordige karakter van dit cytokine familie.
Type I IFN, vooral IFN-α subtypen, worden vaak beschouwd als één entiteit 20-23, in plaats van als een groep nauw verwante maar onderscheiden eiwitten. Het bestaan en de persistentie van meerdere IFN species waaronder IFN-α subtypen gehele evolutie van vertebraten 24 suggereert dat ten minste een subset van deze subtypen specifieke en unieke functies. Het is mogelijk dat het definiëren van patronen IFN expressie ontcijferen helpen karakteriseren de specifieke functies van één of meer van de 17 subtypes. De uitdaging van het bestuderen van de tHij type I en III IFN subtypen gebaseerd op hun gemeenschappelijke sequentie identiteit: de twaalf IFN-α subtypen delen> 50% 25 en IFN-λ subtypen delen 81-96% 26 van hun aminozuursequenties. In de beschreven qRT-PCR assay moleculaire beacon (MB) en vergrendeld nucleïnezuur (LNA) fluorescente probes onderscheid enkel basepaar verschillen tussen de zeer vergelijkbare IFN subtype sequenties en zorgen voor de karakterisering van de handtekening IFN expressie. 384-wells plaat formaat van de test omvat zowel kwantitatieve (transcript normen) en semi-kwantitatieve (het huishouden genen (HKG)) maatregelen, waardoor voor analyse door respectievelijk transcript aantal kopieën en ΔCq. Batch assemblage, gefaciliteerd door geautomatiseerde meerkanaals pipetteren, en lange termijn opslag, mogelijk door het drogen van de primer / probe (Pr / Pb) stelt op de platen, verbetering van de reproduceerbaarheid, het nut en de uitvoerbaarheid van de test.
Dit protocol beschrijft het procesvoorbereidende 384 putjes qRT-PCR assay platen (figuur 1) met tot zeventien verschillende Pr / Pb sets gericht humaan IFN subtypen (Tabel 1). Pr / Pb set werkvoorraad bronplaten (figuur 2) worden gebruikt om meerdere 384-well testplaten bereid in een proces dat kan worden geautomatiseerd met behulp van een robot multichannel pipet. Terwijl de initiële focus lag op het creëren van een protocol voor het bestuderen van de menselijke IFN expressie handtekening, is deze methode toegepast op resusmakaken ook. Hoewel de plaat indelingen zijn iets anders en Pr / Pb sets (tabel 2) gescheiden zijn, de algemene werkwijze voorbereiding voor het creëren van menselijke en rhesus platen identiek. Met minimale aanpassingen van het protocol, kan de werkwijze worden uitgevoerd om de ontwikkeling van assays voor andere groepen van nauw verwante genen te bestuderen.
Zie Figuren 1 en 2 hieronder
Zie de tabellen 1 en 2 Belau
Dit rapport beschrijft het ontwerp, batch-productie, en benadering van de analyse van een test om de transcriptie van een reeks van zeer gelijkaardige genen in een onderzoekslaboratorium instelling te meten. De high-throughput qRT-PCR-test hier gemeld meet de IFN en – λ subtypes met een hoge specificiteit. Deze methode omvat twee belangrijke aspecten, het ontwerp van Pr / Pb sets die onderscheid maken tussen leden van een homoloog gen-familie en de ontwikkeling van een productie-platform voor de ontwikkeling van betrouwbare en consistente 384-wells assayplaten voorgeladen met de Pr / Pb sets. De qRT-PCR-sondes zijn voorzien van een structurele (MB) of chemische (LNA) benadering van het verbeteren van hun specificiteit 29. Voor twee van de primer sets in de rhesus assay (tabel 2), de amplificatie-refractaire mutatiesysteem (ARMS) werd opgenomen in de primer sequenties verder te verbeteren specificiteit 30. Hoewel het algemeen het beste om exon-exon overgangen naar ENHA richtennce specificiteit van een qRT-PCR-reactie, was dit niet mogelijk omdat de type I IFN genen ontbreken intronen. Daarom zal genomisch DNA worden geamplificeerd in de PCR reactie en worden afgebroken door DNase behandeling na RNA-extractie.
Het doelgebied van de Pr / Pb sets beperkt tot de coderende gebieden van de mature peptide voor elke IFN. Vanwege de hoge sequentieovereenkomst tussen de IFN-α subtypen, met name het rijpe peptide regio, was het soms noodzakelijk compromis gevoeligheid specificiteit te garanderen. Dit is vooral het geval bij IFN-α17, waarbij het rijpe peptide transcript vier unieke basen vergeleken met de andere IFN-α subtypen. Targeting IFN-α17 vereist primers die de transcripten van verschillende subtypes te binden, beperken specificiteit van de sonde. Bijgevolg zal de PCR reactie andere subtypen amplificeren dan IFN-α17, waardoor nuttigen van een aanzienlijk percentage van de PCR reagentia en lowering van de amplitude van het fluorescentiesignaal van de specifieke probe voor IFN-α17. Een extra uitdaging richting ontwerpen gevoelige en specifieke Pr / Pb sets voor zeer vergelijkbare genen zoals de IFN is de mogelijkheid dat de geannoteerde sequenties in de GenBank databank niet volledig of volledig te zijn op het moment van ontwerp. Nogmaals, dit was een uitdaging voor IFN-α17, waarbij nieuw geannoteerde sequenties niet perfect uitgelijnd met de versie van de sequentie in de databank op het moment van het ontwerp. Daarom is bij het ontwerpen van Pr / Pb sets voor genen die niet intensief bestudeerd, is het verstandig om regelmatig te controleren of de nieuwste geannoteerde sequentie van een target-gen. Tenslotte is het noodzakelijk dat de Pr / Pb sets niet pseudogenen die kunnen worden overgeschreven, maar niet vertaalde amplificeren.
Na het ontwerpen van de Pr / Pb sets, is de volgende uitdaging het optimaliseren van de PCR-condities van zeventien verschillende Pr / Pb zet op een 384-wells plaat. Transcript normen zijn belang-tant in het testen van de specificiteit van een Pr / Pb-toestel en van essentieel belang voor de harmonisatie van de qRT-PCR-condities van de vele verschillende PCR-reacties worden. Testen van een Pr / Pb set tegen de transcript normen vaststelt zijn efficiëntie en gevoeligheid; plasmiden die zeer soortgelijk pseudogenen expressie nodig zijn opdat de Pr / Pb set meet selectieve transcriptie van het functioneel gen. Het transcript normen bieden een kwantitatieve middel van analyse (aantal transcripten), naast de semi-kwantitatieve analyse ten opzichte van een huishoudgen (ΔCq).
Robotic meerkanaals pipetteren van een 96-well bronplaat in meerdere 384-well testplaten verbetert de nauwkeurigheid en consistentie van inter-plate resultaten. Zalmsperma DNA (ssDNA) wordt gebruikt als een drager die stabiliseert en behoudt de Pr / Pb sets voor langdurige opslag, evenals drogen reagentia afgegeven in de platen. Het drogen van de platen vermindert ook het volume van het reactiemengselnoodzakelijk reproduceerbare resultaten, waardoor bewaart kostbare monsters en vermindert het gebruik van dure reagentia. Door middel van deze stappen, worden batches van platen gemonteerd die precisie en consistentie bieden voor meer dan zes maanden.
Volgende plaat voorbereiding, kwaliteitscontrole maatregelen zijn cruciaal voor de consistentie van een partij van platen controleren. Hiertoe worden vier extra sets normen uitgevoerd op een plaat. De "5x standaard" plaat volgt de prestaties en zorgt voor een dataset aan welke normen een individuele plaat's worden vergeleken. Terwijl tien 10-voudige verdunningen van elk standaard worden gebruikt tijdens testontwerp, ruimte overwegingen dient vier punten worden gebruikt voor de standaardcurve op elke testplaat en de 5x standaardplaat. Daarnaast moet een positieve controle worden opgenomen op elke plaat om de geldigheid van de plaat waarborgen.
Gewoonlijk duurt 3-4 uur met zes testplaten bereiden van een Pr / Pb source plaat; Het is mogelijk om twaalf petrischaal in één dag in een onderzoekslaboratorium. Aangezien elke menselijke IFN subtype testplaat onderzoekt zeventien Pr / Pb sets en geschikt vijftien proefmonsters, een dag van verzameling geeft een partij van platen met de capaciteit om te genereren tot 3060 experimentele gegevenspunten. Ruwe gegevens van de qRT-PCR platform kan worden verwerkt geassembleerd uit programmering scripts in een spreadsheet software een voorgedefinieerde analyse sjabloon automatisch vullen. Deze methode minimaliseert hands-on data entry, waardoor het voorkomen van het kopiëren fouten en stelt de onderzoeker zich richten op data-analyse plaats van gegevens montage. Zoals hier beschreven, kan deze high-throughput qRT-PCR worden toegepast om de expressie van interferon subtypes menselijke of rhesus macaque monsters gemeten en kan worden aangepast voor andere soorten of homologe genen sets. De flexibiliteit van de plaatindeling kan de gebruiker veranderen primer / probe sets voor de genen van maatbelang naar een bepaald celtype of modelsysteem. Deze test kan worden toegepast IFN expressie signaturen meten celcultuurmodellen studeren pathogenen of patiëntmonsters in het kader van ziektemodellen de signalering mechanismen van immuunrespons helderen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door CBER / FDA-NIAID / NIH Interagency overeenkomst yi-AI-6153-01, FDA / CBER intramurale fondsen, en de FDA medische tegenmaatregelen Initiative. TCT, MNB, VPM, LMS, en KDK werden ondersteund door een benoeming in de Research Program Deelname aan het Center for Biologics Evaluation and Research door de Oak Ridge Instituut voor Wetenschappelijk Onderwijs toegediend via een overkoepelende overeenkomst tussen de VS Departmen van Energie en de VS Food and Drug Administration.
0.2mL PCR Tube Strips | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | E0030 124 286 | |
12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-139 | *Discontinued |
12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-137 | *Discontinued |
12-channel Electronic Pipette, 5-250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-118 | *Discontinued |
2.0mL Micro Centrifuge tube, sterile | Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA) | 229446 | |
8-channel Electronic Pipette, 15-1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-115 | *Discontinued |
Disposable Reagent Reservoirs | VWR International (Radnor, PA, USA) | 89094-668 | 25mL reservoirs with 2 dividers |
E-Centrifuge | Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA) | 1090003 | |
Eukaryotic 18S rRNA (18S) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs99999901_s1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
Fixed Speed Mini Vortexer | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 02-215-360 | |
Gas Permeable Adhesive Plate Seal | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB-0580 | Disposable plate seal used during the plate preparation process |
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | Human HKG Primer/probe set |
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Rh02621745_g1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
Hudson Solo automated multichannel pipettor | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800200 | Modified with a 384-well cooling nest |
Linearized plasmids (IFN genes) | Aldevron (Fargo, ND, USA) | Custom Order | Item 3000, 3580; used for assay standards |
LNA inhibitors | Exiqon (Woburn, MA, USA) | Custom Order | Item 500100 |
LNA Probes | Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA) | Custom Order | Material number VC00023 |
Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-193 | |
Matrix Filtered Pipet Tips, 30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-196 | |
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-160 | |
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-152 | |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4309849 | |
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | N8010560 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4311971 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
Microsoft Excel 2010 Spreadsheet | Microsoft (Redmond, WA, USA) | Office 2010 | Visual Basic programming language |
MixMate Vortex Mixer | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | 5353 000.014 | 2 dimensional plate vortex apparatus |
Molecular Beacon Probes | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | Z606634-1EA | |
Plate Dryer (manifold) | Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA) | Custom Order | |
Primer sets | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
pUC57 plasmid DNA | Genescript (Piscataway, NJ, USA) | SD1176 | |
Rnase-Free 1.5mL Microfuge Tubes | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | AM12400 | |
RNase-free DNase Set (50) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 79254 | |
RNase H | New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA) | M0297L | |
RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 74106 | |
Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips) | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800350-S | |
Salmon Sperm DNA Solution | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 15632-011 | |
SoftLinx Version V | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | Custom Order | Software for programming pipetting steps |
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | 4352042 | |
ABgene Adhesive Plate Seals | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB0580 | |
Ubiquitin C (UBC) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs01871556_s1 | Human HKG Primer/probe set |
Verso cDNA synthesis Kit | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB1453B | |
ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4453536 | |
Water-Ultra Pure | Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA) | 351-029-101 | |
Zipvap 384 (plate dryer heating element) | Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA) | 384-109A | Plate Dryer |