乾燥血液スポット - 準備とイムノアッセイや分子技術の使用のための処理

DBS は、100 年²に使用されているが、驚いたことに、ないまだそれらの準備および処理について一般的なコンセンサス。日には、重要な事前分析フェーズの十分な標準化だけで達成されている新生児スクリーニング¹⁴、フィールド DBS テスト^5、16、23の他のすべてのアプリケーションのさまざまな異なるプロトコルが存在するのに対し。イムノアッセイにおける、分子技術によって利用されるように準備と DBS を処理のための包括的なステップバイ ステップの命令をこの通信で紹介し、その有効性に関して評価この顕著な不均一性を克服するためにHBV、HCV、HIV 感染症のマーカーを検出します。次の議論の焦点は、提案されたプロトコルの異なるステップに主に配置されます。

DBS 試験多くの異なるフィルター紙の歴史の中でカードは使用される²をされているが、今日だけ 2 つの商業源は血液コレクション^5、16クラス II 医療機器として FDA の承認します。これらのフィルターのカード システムは均一なそれらのいずれかの上に作製した毛細血管の血液から得られた分析結果は、4-5²⁸以上によって違いはありませんので、非常によく似た吸収特性があります。当然、Masciotra と同僚²⁹ したがって HIV 1 RNA を検出の異なるソースからの血のコレクション カードからの溶出後質的分析と同様します。これらのデータを与えられた、それ事実上除外できます、HBV、HCV のマーカーの血清/DBS のペアを結合をテストするときに観察された不一致のいずれか単独でフィルター カードの選択によって引き起こされた HIV 感染症¹⁷ 。ただし、検体の定量の正確さが必要不可欠である、ソース-ソース バリエーションはもはや無視できるより高度な技術、例えば特定の³⁰または準備の方法としての DBS (PDB) の穿孔乾燥血清スポット (DSS)³¹は¹⁰をテスト従来の DBS の代わりに適用する必要があります。

テスト DB の血の少量のみが使用されるので (毛細管血の 1 滴は約 50 μ l ので構成されています)^5、16、サンプル容積の変化は、重要な、確かに、血清学的結果の間の相違の少なくともいくつか参加者の自己申告の「DRUCK 研究」の操縦中に記録された b 型肝炎ウイルスと c 型肝炎のステータスがこの変数に起因します。サンプル ボリュームの「ゆらぎ」を最小限に抑えるための単一の最も重要な要因は間違いなく技術者²²の注意および継続的なトレーニングによって達成することができますのみキャピラリー採血の正しいテクニックです。さらに、品質管理の指標としてプロシージャを特定し、その後不十分なまたは無効な¹⁶として考慮されなければならない DBS 標本を除くのために既に DBS の使用すべての所に開始べきであるが。

HIV³²のコンテキストで主に研究を行い、高湿度、検体の劣化につながる可能性がありますが、これまで合意に達しているない DBS が乾燥する必要がありますどのくらいの質問について、新生児スクリーニング³³が示されています。.O/N を提案するこの通信では、その後 b 型肝炎や c 型肝炎用にすべて関連出版物^32、34データ DBS のストレージ上の大半で使用されていた条件を採用の間隔を少なくとも 4 時間または好ましくテスト競合しています。1981 年、ヴィラや同僚³⁵、現代的な分析手法を適用した報告 RT で影響はないことの b 型肝炎ウイルスの解析結果 180 日間の全体の観察期間中に抗体があった場合 > 1/1,000、しかしその DBS血清中の抗体だった 1/100 のみ 15 日後境界線正または負の値になった。4 ° C または-20 ° C で保存では、大幅な改善されませんでした。対照的に、30 年後³⁶テストを HBV 陽性のサンプルの複製を調査し、筆者こと、反 HBc も HBs 抗体 HBsAg 同じ条件になったに対し常温では、183 日間安定であった63 日後に既に偽陰性。DBS 波からの HBV DNA の検出、に関してウイルス核酸の濃度³⁷ 37 ° C で少なくとも 7 日間安定していたまたは””3 週間常温保管に耐性があることが判明した³⁸。イムノアッセイ³⁹ -20 ° C、2-8 ° C、および 20-25 ° C にそれぞれ格納されている DBS 試料を用いた 117 日の期間の正確な結果を提供する 2 つの市販第三世代を使用して抗 HCV 抗体のためのテスト。-20 ° C で保存はしかし、光学密度の低い変化につながった。第 4 世代の HCV を適用する elisa 法、すなわちMonolisa c 型肝炎-Ag-Ab-超、DBS、Larratらのテストのコンテキストで⁴⁰ DBS 室温 3 日間以上保管後の解析的特異性の急激な減少を観察その一方で、正確なテスト結果は、さまざまな条件 (-20 ° C、2-8 ° C、22 ~ 26 ° C) の下で 60 日間の Brandao と同僚⁴¹により作製したサンプルを利用した同じキットが得られました。様々 な貯蔵条件下で DBS で HCV RNA 濃度の減少観測範囲 1 年⁴² RT でない重要な変更から周囲温度⁴³で 4 週間後 10 倍に変更です。それ HBV、HCV 抗原、核酸、アカウントに抗体の安定性ではなく競合しているデータを取得、DBS 用に標本を保存するために以前に定義した、合意形成する提案を撤回する合理的なように見えたHIV 検査^{15, 30}: 短期蒸着 (最大 2 週間まで) の抗原、ウイルスの核酸、抗体とみなされる常温では、安定した長期間にわたって最適なストレージは、冷凍条件に対し。

原則として溶出プロトコルを設計するとき 3 つのパラメーターは考慮すべき: (1) 溶出バッファー;(2) の期間および溶出; 温度(3) と溶出量²³。すべての関連した出版物の大半溶出 DBS、ためリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に使用されたほとんどの著者追加タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン (BSA) またはトゥイーン 20、界面活性剤、安定化によるアッセイ信号を改善するために、タンパク質、ソリューション、および同時にブロック非特異的結合サイト²³に入ると。DBS のテストのコンテキストで異なる溶出バッファーを直接比較、のみいくつかのレポートがあります。ヴィラーら³⁶、例えば、記録された PBS/BSA が使用されるすべてのバッファーのほぼ同等の溶出容量 0.5% が非特異的反応性の最も低いレベルで起因しました。非常に似たような観測は、Croom や同僚⁴⁴によって作られたDBS から抗 HCV 抗体の溶出に関する遺伝システム rLAV EIA の検体希釈液を適用する場合。サンプル劣化のリスクが DBS (上記参照) の準備の後の最初の時間で極めて低いのでスポット常温 O/N をインキュベートして穏やかなエンド オーバー エンドの混合による溶出過程をサポートする決定されました。この方法の利点は片パンチ前日直接転送できる定期的な診断に早く次の朝²³.溶出バッファーのボリュームは、希釈倍率を可能な限り低く保つために以降の解析に使用される試金の最小限のそれぞれの条件に適応する必要があります。しかし、慎重にすべての単一の試料の溶離条件の最適化できませんでした前の評価の高いサンプル スループット「DRUCK 研究」¹⁷時に比較的短時間で保証される必要があったので。したがって、むしろ好ましくない 1,000 μ l の PBS ベースのバッファーの量は、2 つの別の操作のすべてのパラメーターの全体の溶出過程を完了するために使用されました。

このアプローチの 1 つ「低抗体濃度; ため、HIV に感染して人々 の反 HBc 抗 HBs システムで完全に失敗する 1 つの手… それは HBV DNA に関して最適な感度を持つ分子生物的プロシージャを必要し、HCV RNA テストです」。¹⁷一方で高い溶出は、一切評価を通して使用されるキットによる抗 HIV ・ HCV、HBsAg 定量に不利なことが分かった。「HBsAg 98.6 %500 μ l または 600 μ、250 μ l、100 μ l のはるかに小さい溶出量を一部使用していた過去の研究と同様に同様に高度の感度で成功した全血波から正物質の検出」^{17、36, 45, 46}。抗 HCV 抗体は既存の結果に対応したため、179 の血清/DBS ペアの調査で決定 97.8% の感度のレポート^{24、44、47、48、49}、5 ~ 10 倍で低かった溶出容量と作業をしていた。「さらに、HCV 検出のためのプロトコルがあった適切に最適化されて. 独自のカットオフ ポイントを定める」^{17、24、48、49} 「または 20 μ から 100 μ l のサンプル ボリュームを増やすことで」。^17、 49最後に、解析的特異性と感度 (100% それぞれ) 抗 HIV の検出のために確立された同等または DBS^50、51のテストに適した他イムノアッセイのパフォーマンス特性に優れた”または、段階的な手順をいくつかの抗 HIV テストの併用」^17、 52。「彼らは、確かに、また突破開発したと DBS 波 (Q 防ぐ HIV 1 + 2 の DBS キット) で抗 HIV 抗体の検出用に最適化された特別なアッセイの実績」^{17, 53}

一緒に取られて、この通信で示される包括的なステップバイ ステップのプロトコルは準備と DBS を処理可能で使いやすいツールであることを証明したし、診断ウイルスで確実にしたがって、使用することができます。それオートメーション⁵⁴を使用してアプローチを可能にしその優れた性能特性により DBS 研究室でテストのグローバル フィールドで将来の一般に認められた合意プロトコルの基礎石の一種として機能する可能性があります。医学。